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Characterization of the Legionella pneumophila GDSL hydrolases PlaA and PlaD regarding enzymatic activity and modulation of host cell signaling

Affiliation
Robert Koch-Institut (RKI)
Hiller, Miriam

The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila is the causative agent for Legionnaires’ disease, a potentially fatal pneumonia. The bacterium is ubiquitous in aqueous habitats and replicates inside protozoa which are its natural host. Infections of humans occur after inhalation of contaminated aerosols. Then, L. pneumophila replicates in a specialized phagosome termed Legionella containing vacuole inside alveolar macrophages. During infection, L. pneumophila secretes proteins, among others phospholipases, via its type II and type IVB secretion systems (T4BSS). L. pneumophila possesses 15 phospholipases A, 3 phospholipases C and 1 phospholipase D. The phospholipases A are further divided into the patatin-like proteins, the PlaB-like proteins and the GDSL hydrolases. 
The aim of this thesis was the characterization of the L. pneumophila GDSL hydrolases PlaA and PlaD with regard to enzymatic activity and the analysis of the interactions of PlaD with the host cell. Thus, L. pneumophila plaA- and plaD- mutants were analyzed in infection assays and purified recombinant proteins were used for investigation of lipolytic enzyme activity and determination of protein structure. Moreover, translocation and interaction assays were performed for the characterization of PlaD. 
PlaA exhibits strong lysophospholipase A activity and is processed by the L. pneumophila zinc metalloproteinase ProA within a disulfide loop in the C-terminal half of the protein increasing the lysophospholipase A activity of PlaA. Additionally, unprocessed PlaA shows glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase activity which is diminished upon processing by ProA. Only minor activity was detected for PlaD. Instead, it was shown that PlaD is Dot/Icm-dependently injected into the host cell cytoplasm where it interacts with regulatory 14-3-3 proteins. Thus, PlaD was described as a novel T4BSS dependent effector protein of L. pneumophila. Moreover, it was found that PlaD is involved in the inhibition of host cell apoptosis upon L. pneumophila infection. 
The generated data lead to the hypothesis that the lysophospholipase A activity of PlaA might be directed towards the membrane of the Legionella containing vacuole and might thus be important for exit from the host cell. It is suspected that PlaD has to be activated by a so far unidentified activator to develop its full activity. Additionally, it is assumed that PlaD functions to modulate the host immune response during infection. 

Legionella pneumophila ist ein fakultativ intrazelluläres Bakterium und Ursache der Legionärskrankheit, einer potentiell tödlichen Pneumonie. Der Erreger kommt ubiquitär in wässrigen Habitaten vor und repliziert intrazellulär in Protozoen, dem natürlichen Wirt. Menschen können durch das Inhalieren kontaminierter Aerosole infiziert werden. In dem Fall repliziert L. pneumophila in einem spezialisierten Phagosom namens „Legionella containing vacuole“ in Alveolarmakrophagen. Während der Infektion sekretiert L. pneumophila Proteine, u.a. Phospholipasen, über Typ II und Typ IVB Sekretionssystem (T4BSS). L. pneumophila besitzt 15 Phospholipasen A, 3 Phospholipasen C und 1 Phospholipase D. Die Phospholipasen A werden zusätzlich in die „Patatin-like proteins“, „die PlaB-like proteins“ und die „GDSL Hydrolasen“ eingeteilt.
Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der GDSL Hydrolasen PlaA und PlaD hinsichtlich enzymatischer Aktivität sowie die Untersuchung von PlaD hinsichtlich Interaktionen mit dem Wirt. Hierzu wurden Infektionsassays mit L. pneumophila plaA- und plaD- Mutanten durchgeführt und aufgereinigtes rekombinantes Protein auf lipolytische Aktivität analysiert sowie zur Bestimmung der Proteinstruktur verwendet. Außerdem wurden für PlaD Translokations- und Interaktionsstudien durchgeführt. 
PlaA zeigt starke Lysophospholipase A (LPLA) Aktivität und wird innerhalb eines Disulfidloops in der C-terminalen Hälfte des Proteins durch die L. pneumophila Zink Metalloproteinase ProA prozessiert, was die LPLA Aktivität steigert. Unprozessiertes PlaA zeigt zudem Glycerophospholipid:Cholesterol Acyltransferase Aktivität, welche durch die Prozessierung verschwindet. Im Gegensatz zeigt PlaD nur sehr geringe Aktivität detektiert. Stattdessen wurde gezeigt, dass PlaD Dot/Icm-abhängig in die Wirtszelle injiziert wird und mit regulatorischen 14-3-3 Proteinen interagiert. PlaD konnte somit als neuer T4BSS abhängiger Effektor von L. pneumophila beschrieben werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass PlaD die Apoptose der Wirtszelle inhibiert.
Die Daten haben zu der Hypothese geführt, dass die Lysophospholipase A Aktivität von PlaA gegen die Membran der „Legionella containing vacuole“ gerichtet und wichtig für das Verlassen der Wirtszelle sein könnte. Es wird vermutet, dass ein bisher nicht identifizierter Aktivator notwendig ist, um die volle Aktivität von PlaD zu entwickeln. Außerdem wird angenommen, dass die Funktion von PlaD in der Modulation der Immunantwort des Wirts liegt.

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