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Impact of Salt Stress on Monoterpene Biosynthesis in SAGE (salvia officinalis L.) and it’s Antimicrobial Activity

Affiliation
Institut für Pflanzenbiologie
Al-Gabbiesh, Ahmad Husni Mohammad

In this project, the impact of abiotic stress on monoterpene biosynthesis is exemplarily examined using different NaCl concentrations of (Salvia officinalis L.) as model system. The major aim of this study was to elucidate the metabolic background of putative stress related changes in the monoterpenes biosynthesis. In this thesis, the content of monoterpenes in the leaves of S. officinalis plants submitted to salt stress have been analyzed. It turned out that salt stress results in an increase in the monoterpenes concentration in comparison to controls. This increase could be due to a passively enhanced rate of monoterpenes biosynthesis, caused by strongly elevated concentration of NADPH + H+ in stressed plants or by an active up-regulation of the gene encoding the key enzymes in terpenoids biosynthesis. In this context, the complex interactions between stress and secondary metabolism are of special interest. The cDNA sequence exhibits a total length of 1000 bp with a putative open reading frame of 735 bp. Salt stress also impacts on the expression of monoterpene synthases; e.g., the amounts of mRNA for bornyl diphosphate synthase and cineole synthase already are strongly enhanced 2 weeks after exposure to NaCl and reach a maximum after 4 weeks. In particular, the impact of salt stress on the monoterpene contents in S. officinalis plants should be analysed. For further clarification, the studies were extended to include also in vitro plants. Accordingly, first, corresponding callus cultures had to be established for the regeneration of S. offiinalis in vitro plants. For the ample understanding of the impact of salt stress on the metabolism of natural products, especially for the differentiation whether the increases in secondary metabolite contents is due to a passive change or caused by an active up-regulation of the biosynthetic enzymes, also the related alterations in the gene expression of the corresponding key enzymes, i.e., the cineole synthase, the bornyl synthase and the sabinene synthase was estimated using 18s and actin as housekeeping genes. In addition, putative stress induced changes in the antibacterial activity of leaf extracts from S. officinalis were monitored, NaCl treated S. officinalis extracts tested against five gram-positive bacteria; S. aureus, S. auricularis, S. microti, B. megaterium and B. cereus and five gram-negative bacteria; E. cloacae, E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa and K. pneumoniae. Antimicrobial activity was determined by measuring the diameter of inhibition zones (DIZ) and the percentage of inhibition. The interaction effect of microorganisms, leaf age and salt concentrations were significant (P ≤ 0.05). Leaf age extracts showed different antimicrobial activity against the tested pathogens and the DIZ was directly proportional to the increase in plant extract concentration reaching a plateau.

In diesem Projekt wird der Einfluss von abiotischem Stress auf die Monoterpenbiosynthese beispielhaft unter Verwendung verschiedener NaCl-Konzentrationen von (Salvia officinalis L.) als Modellsystem untersucht. Das Hauptziel dieser Studie war es, den metabolischen Hintergrund mutmaßlicher stressbedingter Veraenderungen in der Monoterpen-Biosynthese aufzuklaeren. In dieser Arbeit wurde der Gehalt an Monoterpenen in den Blaettern von S. officinalis-Pflanzen analysiert, die Salzstress ausgesetzt waren. Es stellte sich heraus, dass Salzstress zu einer Erhoehung der Monoterpenkonzentration im Vergleich zu Kontrollen fuehrt. Dieser Anstieg koennte auf eine passiv erhoehte Geschwindigkeit der Monoterpenbiosynthese zurueckzufuehren sein, die durch eine stark erhoehte Konzentration von NADPH + H+ in gestressten Pflanzen oder durch eine aktive Hochregulierung des Gens, das die Schluesselenzyme in der Terpenoidbiosynthese codiert, verursacht wird. In diesem Zusammenhang sind die komplexen Wechselwirkungen zwischen Stress und Sekundaerstoffwechsel von besonderem Interesse. Die cDNA-Sequenz zeigt eine Gesamtlaenge von 1000 bp mit einem mutmaßlichen offenen Leserahmen von 735 bp. Salzstress beeinflusst auch die Expression von Monoterpensynthasen; B. sind die Mengen an mRNA fuer Bornyldiphosphatsynthase und Cineolsynthase bereits 2 Wochen nach Exposition gegenueber NaCl stark erhoeht und erreichen nach 4 Wochen ein Maximum. Insbesondere sollte der Einfluss von Salzstress auf den Monoterpengehalt in S. officinalis-Pflanzen analysiert werden. Zur weiteren Klärung wurden die Studien auch auf In-vitro-Pflanzen ausgedehnt. Dementsprechend mussten zunaechst entsprechende Kalluskulturen fuer die Regeneration von S. offiinalis-In-vitro-Pflanzen etabliert werden. Fuer das umfassende Verständnis der Auswirkungen von Salzstress auf den Metabolismus von Naturstoffen, insbesondere fuer die Differenzierung, ob der Anstieg des Sekundaermetabolitengehalts auf eine passive Veraenderung zurueckzufuehren ist oder durch eine aktive Hochregulierung der Biosyntheseenzyme, auch der damit verbundenen Veraenderungen in der Genexpression der entsprechenden Schluesselenzyme, dh der Cineolsynthase, der Bornylsynthase und der Sabinen-Synthase, wurden unter Verwendung von 18s und Actin als Housekeeping-Gene geschaetzt. Zusaetzlich wurden mutmaßliche stressinduzierte Veraenderungen der antibakteriellen Aktivitaet von Blattextrakten aus S. officinalis ueberwacht, NaCl-behandelte S. officinalis-Extrakte gegen fuenf grampositive Bakterien getestet; S. aureus, S. auricularis, S. microti, B. megaterium und B. cereus sowie fuenf gramnegative Bakterien; E. cloacae, E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa und K. pneumoniae. Die antimikrobielle Aktivität wurde durch Messen des Durchmessers der Hemmzonen (DIZ) und des Prozentsatzes der Hemmung bestimmt. Der Wechselwirkungseffekt von Mikroorganismen, Blattalter und Salzkonzentrationen war signifikant (P ≤ 0.05). Blattalterungsextrakte zeigten eine unterschiedliche antimikrobielle Aktivitaet gegen die getesteten Pathogene und die DIZ war direkt proportional zum Anstieg der Pflanzenextraktkonzentration, der ein Plateau erreichte.

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