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Molecular and functional analysis of the exotoxin CNFY of Yersinia pseudotuberculosis YPIII during infection

Affiliation
Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI)
Chaoprasid, Paweena

The cytotoxic necrotizing factor (CNFY) is a single-chain AB toxin produced by pathogenic Yersinia pseudotuberculosis strains YPIII and IP2666 of serotype O3. It plays an important role during Y. pseudotuberculosis infection by modulating pathogenesis. CNFY constitutively activates small GTPase of the Rho family (Rac-1, Cdc42, and RhoA), leading to actin cytoskeleton rearrangements. X-ray crystallography reveals that CNFY is composed of five district domains (D1-D5). However, the function of each domain remains unclear. This study set forth to characterize the function domains of the CNFY and their role for toxin secretion, host cell binding, and intracellular trafficking. This study reveals that the N-terminal domain D1-D2 (residues 1-326) is essential for the export of the toxin from the bacterial membrane via an OMV-independent mechanism. The CNFY toxin is internalized into host cells after binding to one or two receptors, which are recognized by either the domain D1-3 (residues 1-526) or D4-D5 (residues 527-1014) in the N- and C- terminal regions, respectively. The toxin is taken up into early endosomes and translocated into the cytosol from the late endosomes in response to endosome acidification. The negatively charged residues E382 and E382 within domain D1 (residues 327-426) play an important role in the insertion of endosomal membrane. The potential cleavage site is located between D3 and D4 (residues 542-545) which removes the catalytic domain D5 (residues 720-1014) and releases it into the cytosol together with domain D4 (residues 527-719) to deamidate Rho GTPases. Moreover, a new function of virulence factor, PsaA, was identified on the surface of the outer membrane vesicles of Y. pseudotuberculosis. Here, we reported that the PsaA protein promotes cell death in HEp-2 cells by inducing vacuolation, followed by mitochondrial and ER stress. In conclusion, the present work provided insights into the function of CNFY domains and the intoxication process during infection. Moreover, we successfully use different CNFY variants to deliver proteins such as GFP and beta-lactamase into host cells. CNFY seems to target specific cell types due to receptor specificity, this may allow for the treatment of a subset of cell types. Therefore, this study highlights CNFY can be used to develop therapeutic molecule-based fusion proteins for direct delivery into host cells.

Der zytotoxisch-nekrotisierende Faktor (CNFY) ist ein einkettiges AB-Toxin, das von den pathogenen Yersinia pseudotuberculosis-Staemmen YPIII und IP2666 des Serotyps O3 produziert wird. CNFY spielt eine wichtige Rolle bei der Infektion mit Y. pseudotuberculosis da es die Pathogenese moduliert. Es aktiviert konstitutiv GTPasen der Rho-Familie (Rac-1, Cdc42 und RhoA), was zu Umlagerungen des Aktin-Zytoskeletts fuehrt. Roentgenkristallographie zeigte, dass CNFY aus fuenf Subdomaenen, D1-D5, besteht. Die Funktion der einzelnen Domaenen blieb jedoch unklar. Das Ziel dieser Studie war die Charakterisierung der funktionellen Domaenen des CNFY-Toxins und ihrer Rolle bei der Toxinsekretion, der Bindung an die Wirtszellen und bei der intrazellulaeren Weiterleitung. Die aktuelle Studie zeigt, dass die N-terminalen Domaenen D1-D2 (Aminosaeuren 1-326) fuer den Export des Toxins durch die Bakterienmembran ueber einen OMV-unabhaengigen Mechanismus. Das CNFY-Toxin wird nach Bindung an einen oder zwei Rezeptoren, die entweder von den Domaenen D1-D3 (Aminosaeuren 1-526) oder von D4-D5 (Aminosaeuren 527-1014) erkannt werden, in die Wirtszellen internalisiert. Das Toxin wird daraufhin in fruehe Endosomen aufgenommen und nach Ansaeuerung der Endosomen in das Zytosol transloziert. Die negativ geladenen Reste E382 und E382 innerhalb der Domaene D1 (Aminosaeuren 327-426) spielen eine wichtige Rolle bei der Insertion des Toxins in die endosomale Membran. Die potentielle Schnittstelle befindet sich zwischen D3 und D4 (Aminosaeuren 542-545), wodurch die katalytische Domaene D5 (Aminosaeuren 720-1014) abgespalten und zusammen mit der Domaene D4 (Aminosaeuren 527-719) in das Zytosol freigesetzt wird, wo es daraufhin Rho-GTPasen desamidiert. Darueber hinaus wurde in dieser Studie ein neuer Funktion des Virulenzfaktor, PsaA, in Assoziation mit Aussenmembranvesikeln von Y. pseudotuberculosis identifiziert. Hier konnte gezeigt werden, dass das PsaA-Protein den Zelltod von HEp-2-Zellen foerdert, indem es verstaerkte Vakuolisierung induziert, woraufhin es zu mitochondrialem und ER Stress kommt. Zusammenfassend lieferte die vorliegende Arbeit Einblicke in die Funktion der CNFY-Domaenen und den Intoxikationsprozess waehrend der Infektion. Es wurden verschiedene CNFY-Varianten verwendet und gezeigt, dass CNFY genutzt werden kann, um Proteine wie GFP und beta-Laktamase in Wirtszellen zu transportieren. Aufgrund seiner Rezeptorspezifitaet kann CNFY zudem als Vehikel die spezifische Behandlung bestimmter Zelltypen ermoeglichen. 

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