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Entwicklung und Charakterisierung eines in-vitro kultivierten humanen cornealen Stroma-Ersatzes zur Augenoberflächenrekonstruktion

Hasenzahl, Meike

Eine gesunde Cornea ist essenziell wichtig für das Sehvermögen. Die Transplantation einer Spenderhornhaut kann bei einer Vielzahl von Erkrankungen der Augenoberfläche das Sehvermögen wiederherstellen. Da die Verfügbarkeit der Spenderhornhäute nicht ausreicht, um den Bedarf zu decken, eröffnet die In-vitro-Rekonstruktion, das sogenannte Tissue Engineering, vielversprechende Möglichkeiten. 
In dieser Arbeit wurden primäre, corneale Stromazellen aus humanen Hornhäuten isoliert und in-vitro über mehrere Wochen kultiviert. Der Einfluss verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die Bildung eines zusammenhängenden, von der Kultivierungsoberfläche ablösbaren Zellsheets, bestehend aus Zellen und extrazellulärer Matrix (EZM) wurde untersucht. Die Zellen wurden in unterschiedlichen Zelleinsaatdichten und mit verschiedenen Konzentrationen an Mediensupplementen wie Vitamin C, fetalem bovinem Serum und L-Glutamin kultiviert. Des Weiteren wurde der Einfluss von Kollagenbestandteilen (Glycin, L-Prolin, L-4-Hydroxyprolin) und der Einfluss von TGF-β1, bFGF, IGF-2, PDGF-BB und Insulin auf die Proliferation, die Kollagen- sowie die Glykosaminoglykansynthese der Zellen untersucht. Zur besseren Standardisierbarkeit wurde außerdem ein serumfreies Kultivierungsmedium entwickelt.
Die entstehenden Zellsheets wurden hinsichtlich ihrer Lichttransmission, Ultrastruktur und biomechanischen Eigenschaften charakterisiert. 
Die Synthese EZM wurde durch die Kultivierung der Zellen mit Insulin, TGF-β1 und Vitamin C signifikant erhöht. Die Zellsheets wiesen eine hohe Lichttransmission, geeignete Materialeigenschaften und teilweise Ähnlichkeiten zur Ultrastruktur der humanen Hornhaut auf. Die EZM bestand, wie das corneale Stroma, vor allem aus Kollagen Typ I und zu kleineren Anteilen aus Kollagen Typ V und Typ III. Die für das humane Stroma charakteristische Anordnung der Kollagenfibrillen, parallel zueinander und in Lamellen übereinander, konnte in einigen Bereichen der Zellsheets gefunden werden. 
Eine serumfreie Kultivierung der Zellen mit TGF-β1-haltigem Medium resultierte in einem zusammenhängenden Zellsheet, während die Kultivierung ohne TGF-β1 zu fragilen Sheets führte.
Die Arbeit beschreibt die Entwicklung eines im Querschnitt in-vivo-ähnlichen Stroma-Konstrukts durch Übereinanderstapeln der Zellsheets. Hier scheint eine serumfreie Kultivierung der Zellsheets übereinander in einer Zellkrone (zwei Edelstahlzylinder, zwischen denen das Konstrukt eingespannt wird) vielversprechend zu sein.

A healthy cornea is essential for vision. The transplantation of a donor cornea can restore vision in a variety of ocular surface diseases. Since the availability of donor corneas is insufficient to meet the demand, in vitro reconstruction, so-called tissue engineering, provides promising possibilities. 
In this work, primary corneal stroma cells were isolated from human corneas and cultivated in-vitro over several weeks. The influence of different cultivation conditions on the formation of a coherent cell sheet consisting of cells and extracellular matrix (ECM), which can be detached from the cultivation surface, was investigated. The cells were cultivated at different cell seed densities and with different concentrations of media supplements such as vitamin C, fetal bovine serum and L-glutamine. Furthermore, the influence of collagen components (glycine, L-proline, L-4-hydroxyproline) and the influence of TGF-β1, bFGF, IGF-2, PDGF-BB and insulin on cell proliferation, collagen and glycosaminoglycan synthesis was investigated. In addition, a serum-free culture medium was developed for better standardization.
The resulting cell sheets were characterized with respect to light transmission, ultrastructure and biomechanical properties. 
The synthesis of ECM was significantly increased by culturing the cells with insulin, TGF-β1 and vitamin C. The cell sheets showed high light transmission, suitable material properties and partial similarities to the ultrastructure of the human cornea. The ECM, like the corneal stroma, consisted mainly of collagen type I and to smaller parts of collagen type V and type III. The arrangement of collagen fibrils, parallel to each other and in lamellae on top of each other, which is characteristic for the human stroma, could be found in some areas of the cell sheets.
Serum-free cultivation of the cells with TGF-β1-containing medium resulted in a coherent cell sheet, while serum-free cultivation without TGF-β1 resulted in fragile sheets.
Finally, the work describes the development of a cross-sectional in-vivo-like stroma construct by stacking the single cell sheets on top of each other. Here, a serum-free cultivation of the cell sheets on top of each other in a cell crown (two stainless steel cylinders between which the construct is clamped) seems promising. 

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