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Insights into the regulation and post-transcriptional modifications of the molybdenum cofactor biosynthesis in Neurospora crassa

Wajmann, Simon GND

The transition metal molybdenum (Mo) is present in all kingdoms of life, bound to vitally crucial enzymes. Mo itself is biologically inactive and needs a scaffold to serve as part of the active site of its user enzymes. This scaffold is a pyranopterin compound called molybdopterin (MPT). The four steps of MPT synthesis and Mo insertion, leading to the final pathway product molybdenum cofactor (Moco), are highly conserved. Moco plays an essential role in nitrate assimilation by binding to the active site of nitrate reductase (NR), the first and rate-limiting enzyme of this pathway. While the literature describes the regulatory mechanisms of nitrogen catabolism in detail, the knowledge about eukaryotic Moco biosynthesis regulation is limited.

The focus of this work was to give first insights into the mechanisms leading to optimal Moco biosynthesis activity under Moco demanding conditions. For this, I used the fungal model organism Neurospora crassa and revealed a tight connection between enhanced NR expression and the Moco biosynthesis rate. The transcript quantification of genes involved in Moco biosynthesis showed that nit-7, encoding for the first step of Moco biosynthesis, is the critical point of regulation. While Moco demand caused the up-regulation of non-spliced nit-7 expression (encoding for NIT-7A), I saw no regulation of the splice variant encoding for NIT-7AB. The mRNA analysis identified a third, yet unknown splice variant, also encoding for NIT-7A. Following these findings, I examined the interplay of these variants, their encoded enzymes, and potential new protein products in different in vivo experiments.

Mutagenesis and rescue studies showed that the NIT-7 A- and B-domain together catalyze the conversion of guanosine-5’-triphosphate to cyclic pyranopterin monophosphate (cPMP). NIT-7A harbors the sole mitochondrial targeting signal, and thus, NIT-7B requires the fusion to an inactive A-domain for its translocation. After import, the mitochondria separate the domains of NIT-7AB and degrade the A-domain. Not only fungi but also animals exhibit the fusion of A- and B-domain of NIT-7 orthologs. The precise analysis of the NIT-7 import identified that the opisthokont-branch developed at least two different strategies to orchestrate the cytoplasmic export of fused cPMP-synthase enzymes.

Das Übergangsmetall Molybdän (Mo) ist in allen Reichen des Lebens, gebunden an essentielle Enzyme, vorhanden. Mo selbst ist biologisch inaktiv und benötigt daher ein Rückgrat um im aktiven Zentrum dieser Enzyme zu dienen. Dieses Rückgrat ist ein Pyranopterin Ringsystem, das Molybdopterin (MPT) genannt wird. Die vier Schritte der MPT Synthese und Mo Bindung, welche zum finalem Produkt Molybdän Cofaktor (Moco) führen, sind hochkonserviert. Moco spielt durch die Bindung an die Nitrat Reduktase (NR), dem ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Enzym dieses Stoffwechselweges, eine essentielle Rolle in der Nitrat-Assimilation. Während die regulatorischen Mechanismen des Stickstoff-Katabolismus detailliert beschrieben wurden, ist das Wissen über die Regulation der eukaryotische Moco Biosynthese beschränkt.
Diese Arbeit zeigt erste Einblicke in die Mechanismen, die zur optimalen Moco Biosynthese Aktivität unter Moco erfordernden Bedingungen führen. Hierfür verwendete ich den Pilz Neurospora crassa als Modellorganismus und deckte eine enge Verknüpfung zwischen erhöhter NR Expression und Moco Biosynthese auf. Die Quantifizierung der Gen-Transkripte der Moco Biosynthese zeigte, dass nit-7, welches für den ersten Schritt der Moco Biosynthese kodiert, ein kritischer Punkt der Regulation ist. Während Moco Bedarf zur Hochregulierung der Expression von nicht-gespleißtem nit-7 (kodierend für NIT-7A) führt, ist keine Regulation der NIT-7AB kodierenden Spleißvariante zu beobachten. Durch eine mRNA Analyse identifizierte ich eine dritte, bisher unbekannte Spleißvariante, die auch für NIT-7A kodiert. Daran anknüpfend untersuchte ich die Wechselwirkungen aller Varianten, ihrer kodierenden Enzyme und potentiell neuer Proteinprodukte in verschiedenen in vivo Experimenten.
Mutagenese- und „rescue“-Untersuchungen zeigten, dass die NIT-7 A- und B-Domäne zusammen die Umwandlung von Guanosintriphosphat zu zyklisches Pyranopterinmonophosphat (cPMP) katalysieren. NIT-7A beinhaltet das einzige mitochondrielle Lokalisierungssignal und daher benötigt NIT-7B für die Translokalisierung die Fusion an die inaktive A-Domäne. Nach dem mitochondriellem Import werden die Domänen von NIT-7AB getrennt und die A-Domäne abgebaut. Auch Tiere weisen eine Fusion der A- und B-Domänen der NIT-7 orthologen Proteine auf. Die genaue Analyse des NIT-7 Imports zeigte, dass Opistokontha mindestens zwei verschiedene Strategien für den zytoplasmatischen Export der fusionierten cPMP-Synthase Enzyme entwickelt haben.

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