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Identification of novel tumor associated proteins in head and neck cancer using patient derived fresh tissue cDNA libraries and antibody repertoires

Zilkens, Kilian Johannes Carl

There is an increasing demand for the discovery of novel therapeutic targets in immunotherapy. Novel applications of immunotherapies in turn require specific biomarkers to guide treatment, monitor disease and to predict patient outcome, further increasing the need for discovery. Typical discovery ventures make use of proteomics and transcriptomics approaches that try to provide solutions via big data or rely on screening of common peptide or protein libraries against large numbers of patient sera. Though effective in some cases, such large scope techniques generally do not take into account patient-specific phenotypes and might thereby miss individual indications. This study presents a novel approach for the selection of potential biomarkers and therapeutic targets using fresh tumor tissue and patient antibody repertoires. Patient specific cDNA antigen libraries were created from head and neck cancer tissues. Autologous antibody repertoires obtained from tumor infiltrating B cells (TIBC) or patient sera were used for selection of protein fragments via M13 phage display.

The technology was tested successfully by selecting mesothelin (MSLN) peptides from HCT116 cell line antigen libraries using anti-MSLN antibody SUW57-D11. Panning in solution in combination with phage ELISA screening was found to be the most promising workflow for biomarker and target discovery. High throughput applicability of this method was confirmed through successful selections in 96-well format and by employing next generation sequencing (NGS) as a single massively parallel screening method to replace ELISA.

Using antibodies from TIBC, protein fragments of known cancer therapy target MMP9 were isolated from the antigen libraries, providing proof of principle for the identification of potential therapeutic targets. Furthermore, SHTN1 and WWC2 protein fragments were enriched in a similar approach. Using patient sera, EEA1 emerged as a protein of interest. The presented technology allows target and biomarker discovery based on patient specific local and systemic immune responses. This approach yields candidates with an implied relevance by basing the selection process on a biological mechanism within the disease context. The workflow has the capacity to be advanced towards a target and biomarker discovery platform that is applicable not only to cancer, but to diseases that require immunotherapeutic interventions in general.

 

In der Immuntherapie existiert eine steigende Nachfrage an neuen therapeutisch angreifbaren Zielstrukturen. In gleichem Maße sind Biomarker gefordert, um Behandlungsentscheidungen zu leiten, den Krankheitsfortschritt zu überwachen und Folgen für die Patienten vorherzusagen. Übliche Unternehmungen zur Entdeckung neuer Zielstrukturen basieren auf Proteomik und Transkriptomik, welche aus großen Datenmengen Lösungen ableiten, oder auf der Selektion von einzelnen Peptid- oder Proteinbibliotheken gegen eine Vielzahl von Patientenseren. Diese umfangreichen Techniken erfassen normalerweise keine patientenspezifischen Phänotypen und können deshalb individuelle Indikationen übersehen. Diese Studie präsentiert einen neuartigen Ansatz zur Selektion von potentiellen Biomarkern und therapeutischen Zielstrukturen mit Hilfe von Tumorgeweben und Patientenantikörpern. Aus frischen Kopf-, Halstumorgeweben wurden cDNA-Antigenbibliotheken generiert. Autologe Antikörperrepertoire aus tumorinfiltrierenden B-Zellen (TIBZ) oder Patientenseren wurden zu deren Selektion im M13 Phagendisplay verwendet. Durch die Selektion von Mesothelinpeptiden aus HCT116 Zellinien-Antigenbibliotheken mittels des anti-Mesothelin Antikörpers SUW57-D11 konnte die Technologie erfolgreich getestet werden. Phagendisplay in Lösung und Selektion mittels Phagen-ELISA wurde als vielversprechender Arbeitsablauf für die Entdeckung von Biomarkern und Zielstrukturen erarbeitet. Die Anwendbarkeit der Methode im Hochdurchsatzverfahren wurde durch erfolgreiche Selektionen im 96-well-Format und mittels der Anwendung hochparalleler Sequenzierung zur Selektion bestätigt. Mit Antikörpern aus TIBZ konnte MMP9 als Zielstruktur isoliert werden. Dies ist ein prinzipieller Beweis für die Funktionalität der Methode. Des Weiteren wurden Proteinfragmente von SHTN1 und WWC2 in einem ähnlichen Ansatz angereichert. Unter Verwendung von Patientenseren, hat sich EEA1 als interessantes Protein herausgestellt. Die präsentierte Technologie erlaubt die Entdeckung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern basierend auf patientenspezifischen Immunreaktionen. Dieser Ansatz bringt Kandidaten mit implizierter Relevanz hervor, da der Selektionsprozess auf einem biologischen Mechanismus im Krankheitskontext beruht. Der Arbeitsablauf besitzt die Kapazität zu einer Plattform für die Entdeckung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern ausgebaut zu werden, die auf alle Krankheiten, die immuntherapeutische Interventionen benötigen, anwendbar ist.

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Zilkens, K.J.C., 2020. Identification of novel tumor associated proteins in head and neck cancer using patient derived fresh tissue cDNA libraries and antibody repertoires. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-202009031200-0
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