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Parametrische Untersuchung des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die Barriereeigenschaften von hCMEC/D3 Zellen unter Verwendung eines dynamischen Zellkulturmodells

Hinkel, Sarah

Um bereits in der frühen Entwicklungsphase die Durchlässigkeit potentieller Wirkstoffe durch die Blut-Hirn-Schranke abschätzen zu können, sind zuverlässige in vitro-Zellkulturmodelle erforderlich. Eine breite Anwendung findet hierbei die humane Zelllinie hCMEC/D3, wobei ihre mäßig restriktiven Barriereeigenschaften einen erheblichen Nachteil darstellen. Eine Erklärung für ihre geringe Barriereintegrität und der hohen Durchlässigkeit für Natriumfluoreszein und FITC-Dextran 4 kDa lieferte die immunzytochemische Untersuchung wichtiger TJ-Proteine. So waren Occludin, ZO-1 und Claudin-5 größtenteils zytosolisch lokalisiert und nicht wie erwartet intramembranös. Hiervon ausgehend wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene statische sowie dynamische Kultivierungsvariationen zur Verbesserung der Barrierefunktionalität analysiert.   Bei der Untersuchung verschiedener Zellkulturmedien stellten sich die Medien ECGM MV-2, MCDB 131 und das serumfreie Medium hESFM neben dem Standardmedium EGM-2 am geeignetsten heraus. Allerdings zeigte keines der untersuchten Medien einen positiven Einfluss auf die endotheliale Barrierewirksamkeit. Auch verschiedene Beschichtungsmaterialien (Laminin, Kollagen, und Fibronektin), Medienzusätzen (Serum, Hydrocortison, Calcium und pCPT-cAMP kombiniert mit Ro-20-1724), Porengrößen (0,4, 1,0, 3,0 µm) und Ko-Kultivierungsvariationen (direkt und indirekt mit SVGmm) verbesserten die Barriereintegrität der hCMEC/D3 Zellen nicht. Zudem wurde der Einfluss einer dynamischen Kultivierung unter Anwendung des Zellkulturmodells DynaMiTES untersucht. Zunächst wurden die Kultivierungsbedingungen erfolgreich an das DynaMiTES-Design angepasst, indem die Aussaatrichtung von normal auf invers geändert wurde. Die Endothelzellen wurden bei einer Flussrate bis 3,33 ml/min für 3 h und bei 0,03 ml/min für 72 h ohne einen Verlust der Zellviabilität und der Zellzahl kultiviert. Jedoch blieben die Barriereeigenschaften der Endothelzellen unter allen untersuchten Flussraten unverändert.

Die Ausbildung dichter Zell-Zell-Kontakte ist eine Voraussetzung für die restriktiven Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die hCMEC/D3 Zelllinie, trotz der getesteten Kultivierungsvariationen, nicht für Permeationsstudien von niedermolekularen Arzneimittelkandidaten geeignet ist. Somit bleibt der Bedarf nach einer Zelllinie mit restriktiven Barriereeigenschaften weiterhin bestehen. 

Reliable in vitro cell culture models are required to estimate the brain accessibility in the early phase of drug development. For this purpose the human endothelial cell line hCMEC/D3 is widely used, but its moderately restrictive barrier properties are a considerable disadvantage. The low barrier integrity and high permeability for sodium fluorescein and FITC-dextran 4 kDa might be due to the incomplete formation of tight junction proteins. Thus, ZO-1, occludin and claudin-5 were mostly cytosolically localized and not intramembranously, as expected. Based on this, various static and dynamic cultivation variations were analyzed to improve barrier functionality of hCMEC/D3 cells regarding an in vivo-like blood-brain barrier model for drug permeation studies.

Firstly, the effect of ten different cell culture media, including two serum-free ones, on barrier properties was investigated. Besides the standard medium EGM-2, the basal media ECGM MV-2, MCDB 131 and the serum-free medium hESFM seemed to be most suitable. Though, none of the tested cell culture media showed a positive effect on the barrier integrity of the endothelial cell line. Variations of different coating materials (laminin, collagen and fibronectin), media supplements (serum, hydrocortisone, calcium and pCPT-cAMP combined with Ro 20 1724), pore sizes (0.4, 1.0, 3.0 µm) and co-cultivation variations (directly and indirectly with SVGmm) did not improve the barrier integrity of the hCMEC/D3 cells. Furthermore, the cell line was cultivated under dynamic conditions using the cell culture model DynaMiTES. The cultivation conditions were successfully adapted to the DynaMiTES design by changing the seeding orientation from normal to inverse. The endothelial cells were cultivated for 3 h at a flow rate up to 3.33 ml/min and for 72 h at a flow rate of 0.03 ml/min without loss of cell viability and cell count. However, the barrier integrity of the endothelial cell line remained unchanged under all dynamic conditions.      The formation of tight cell-cell contacts is essential for the restrictive properties of the blood-brain barrier. The results show that the hCMEC/D3 cell line is not suitable for permeation studies of small molecule drug candidates. Even after the tested cultivation variations the hCMEC/D3 model showed considerable limitations and therefore the need for an alternative cell line with restrictive barrier properties remains. 

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Hinkel, S., 2020. Parametrische Untersuchung des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die Barriereeigenschaften von hCMEC/D3 Zellen unter Verwendung eines dynamischen Zellkulturmodells. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-202008121326-0
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