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Respirasome-mediated Activation of T-Lymphocytes

Meston, Daniel Jon ORCID

T cell activation depends from mitochondrial derived reactive oxygen species (mtROS). However, a thorough mechanistic knowledge of how and where mtROS acts in the signaling network of activated T cells is missing. This thesis aimed (i) to evaluate the mtROS signaling network in activated primary human T cells and (ii) to reveal the impact of mtROS signaling on immune phenotypes and effector functions. First, an mtROS inducible model based on primary human CD4+ T cells was established and probed with proteomics. By utilizing an isobaric thiol switching strategy, I performed a redox proteomic study quantifying cysteine residues susceptible to oxidation. 4784 cysteine-containing peptides could be assigned and quantified in this thesis. Of those, I identified 76 cysteine residues that were differentially oxidized upon T cell activation. Components of mitochondrial metabolism, cytoskeleton dynamics and zinc binding were enriched. As zinc finger proteins are known to mediate transcription/translation and can be modulated via the exclusion of the coordinated zinc ion which is known to dissociate following an increase in oxidative milieu I hypothesized an impact on protein turnover. To investigate mtROS-dependent translation, I employed the non-canonical amino acid (NCAAs), Azidohomoalanine (AHA), which incorporates into newly synthesized proteins and can be used to enrich translated proteins to explore changes in mtROS dependent protein transcription. 376 newly synthesized proteins from all conditions were identified, which allowed me to characterize the impact of mtROS on downstream transcription following activation. I identified two groups of proteins, which were antioxidants and proteins that upregulated NF-κB which is known to upregulate antioxidant processes and T cell activators which are known to be upregulated during T cell activation to modulate transcription factors, such as NFAT binding proteins. This work has highlighted the impact of mtROS on T cell expansion through NFAT and effector function through NF-κB. Taken together, this thesis has characterized the mechanistic impact of mtROS in T cell activation as well as the downstream regulatory processes, which constitute an mtROS dependent signaling network to achieve full T cell activation. 

Die Aktivierung von T Zellen erfolgt durch reaktive Sauerstoffverbindungen, welche in Mitochondrien gebildet werden (mtROS). Wobei die Bedeutung von mtROS als Signalmolekül erst vor kurzem erkannt wurde. Allerdings ist bisher ungeklärt wie und wo mtROS mechanistisch in die Signalwege von T-Zellen eingreift. Diese Doktorarbeit zielt daher auf (i) eine Charakterisierung der mtROS-abhängigen Signalnetzwerke in aktivierten T-Zellen mittels moderner Proteomik und (ii) die Identifizierung der durch mtROS vermittelten Immunantworten. Zu Beginn dieser Arbeit wurde ein zelluläres Modellsystem etabliert, welches die Induktion von mtROS in primären humanen CD4+ T-Zellen erlaubt, und mit modernen Methoden der Proteomik kombiniert werden kann. Unter Verwendung einer isobaren und Thiol-spezifischen Markierungsstrategie wurde eine Redoxproteom-Studie durchgeführt, welche die genaue Quantifizierung von oxidativen Prozessen an Cysteinen erlaubt und zur Untersuchung der mtROS-abhängigen Modifikationen in T-Zellen von gesunden Spendern genutzt wurde. Ingesamt wurden in dieser Arbeit 4784 Cystein-haltige Peptide analysiert und quantifiziert. Von diesen, konnten an 76 Cysteinen durch Massenspektrometrie eine Veränderung des Oxidations-Status nach T-Zell Aktivierung nachgewiesen werden. Komponenten des mitochondrialen Metabolismus wurden Regulatoren der Zytoskelettdynamik und der Zinkbindung angereichert. Da ein oxidatives Milieu Zink Ionen aus dem Bindungsmotiv verdrängen und Strukturänderungen herbeiführen kann, kann durch Identifizierung der oxidierten Cysteine erstmals ein Mechanismus zur mtROS-abhängigen Translation. Durch diese Proteomstrategie konnte die Translation von Proteinen unter physiologischen Bedingungen der T-Zell Aktivierung sowie in Anwesenheit von Katalase untersucht werden, welche die Bildung von mtROS spezifisch reduzierte. Insgesamt konnte in dieser Arbeit die Translation von 376 Proteinen unter verschiedenen Bedingungen nachgewiesen werden, und ermöglichten die Bedeutung von mtROS für den Phänotyp aktivierter T-zellen zu charakterisieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Ergebnisse dieser Doktorarbeit die Bedeutung von mtROS als Signalmolekül bestätigen und erstmals die durch mtROS beeinflussten Signalwegen und zellulären Prozessen berichtet. Aufgrund des physiologischen Modellsystems tragen diese Prozesse unmittelbar zum Verständnis der Aktivierung der T-Zell Immunität bei.

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Meston, D.J., 2020. Respirasome-mediated Activation of T-Lymphocytes. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-202008120926-0
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