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Uncovering factors allowing high carbohydrate active enzyme production in the thermophilic filamentous fungus Thermoascus aurantiacus

Gabriel, Raphael

Fungal carbohydrate active enzymes (CAZy) are vital for various industrial applications such as the conversion of plant biomass to biofuels and bio-based chemicals. The thermophilic filamentous fungus Thermoascus aurantiacus is an intriguing host for cellulase production and produces considerable quantities of cellulases and xylanases which retain high activity above 65 °C. The goal of this thesis was to uncover (1) CAZy induction and (2) CAZy gene regulation in T. aurantiacus and (3) learn from classical fungal CAZy hypersecreting Neurospora crassa mutants how to improve fungal enzyme secretion to design improved genetic- and bioprocess engineering strategies. This work involved extensive methods development and established vital knowledge for improving cellulase production with T. aurantiacus. Xylan lead to secretion of high amounts of cellulases and xylanases, while simple C5 and C6 sugars and cellobiose failed to significantly induce CAZy expression in batch cultures, presumably due to carbon catabolite repression (CCR). The development of a continuous feed setup allowed to circumvent CCR while feeding low amounts of potential inducers into 50 mL shake flask cultures. One major obstacle that prevents employing new fungal strains is the lack of genetic transformation systems. Here we report on successful Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the thermophilic fungus T. aurantiacus, a producer of highly heat-stable plant cell wall degrading enzymes. We optimized the transformation efficiency of the newly developed protocol and overexpressed the transcriptional xylanase regulator xlnR, clr1 and clr2, which led to increase in xylanase activity of the mutant strain. Finally, we sought to learn from classical fungal CAZy hypersecreting mutants how to increase enzyme secretion in T. aurantiacus. The mutation causing CAZy hypersecretion in the long-known N. crassa exo-1 mutant was identified through genome resequencing and genetic tests: a premature stop in the F-box protein-encoding gene exo-1. As known for the exo-1 mutant, high invertase, amylase and pectinase activity was found in the corresponding deletion strain upon sugar depletion. While the exo-1 gene homolog is missing in T. aurantiacus, the enzyme hypersecretion phenotype could be successfully reverse-engineered through collaborators into the industrially employed thermophilic fungus Myceliophthora thermophila through CRISPR/Cas9, leading to high amylase secretion.

Kohlenhydrat-aktive Enzyme (CAZy) von filamentösen Pilzen sind für verschiedene industrielle Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Der thermophile filamentöse Pilz Thermoascus aurantiacus ATCC 26904 produziert beträchtliche Mengen an Cellulasen und Xylanasen, die auch bei Temperaturen über 65 °C eine hohe Aktivität beibehalten. Wärmestabile Enzyme bieten zahlreiche Vorteile für die kosteneffiziente Herstellung von Biokraftstoffen. Das Ziel dieser Arbeit war es, (1) die CAZy-Induktion und (2) die CAZy-Genregulation von T. aurantiacus aufzuklären und (3) von klassischen CAZy hypersekretierenden Neurospora crassa Mutanten zu lernen, wie die Pilzenzymsekretion erhöht werden kann, um mit diesem Wissen verbesserte Genmodifikations- und Bioprozessentwicklungsstrategien zu generieren. Xylan führte zur Sekretion hoher Mengen an Cellulasen und Xylanasen, während einfache C5- und C6-Zucker und Cellobiose die CAZy-Expression in Batch-Kulturen nicht signifikant induzierten. Dies ist vermutlich auf Kohlenstoffkatabolitrepression (Englisch: carbon catabolite repression, CCR) zurückzuführen. Die Entwicklung eines neuartigen Testverfahrens zur Induktorenidentifikation, basierend fed-batch Prozessen von Zuckerinduktoren, ermöglichte es jedoch CCR zu umgehen. In dieser Arbeit wurde zudem eine erfolgreiche Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation des thermophilen Pilzes T. aurantiacus etabliert. Wir optimierten die Transformationseffizienz des neu entwickelten Protokolls und nutzten es zur Überexpression des Xylanasenegulators xlnR, clr1 und clr2 was zu einem Anstieg der Xylanaseaktivität der generierten Mutantenstämme führte. Zusätzlich wollten wir von klassischen CAZy hypersekretierenden Pilzmutanten lernen, wie die Enzymsekretion erhöht werden kann. Die Mutation, die eine CAZy-Hypersekretion in der seit langem bekannten N. crassa exo-1-Mutante verursacht, wurde durch Genom-Resequenzierung und genetischen Tests identifiziert: ein vorzeitiges Stoppcodon im F-Box-Protein-kodierenden Gen exo-1. Wie für die klassische exo-1-Mutante bekannt, wurde auch in einem entsprechenden Gen-Deletionsstamm nach dem Konsum freier Zucker im Medium eine hohe Invertase-, Amylase- und Pektinaseaktivität gefunden. Kooperationspartner konnten den Phänotyp der Enzymhypersekretion erfolgreich in den industriell eingesetzten thermophilen Pilz Myceliophthora thermophila über CRISPR/Cas9 reproduzieren.

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Gabriel, R., 2020. Uncovering factors allowing high carbohydrate active enzyme production in the thermophilic filamentous fungus Thermoascus aurantiacus. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-202005271122-0
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