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Discovery of novel therapeutic antibodies and targets using tumor-infiltrating B cells

Philippi, Melanie

Tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) have been shown to contribute to anti-tumor immunity and improved survival in different types of cancer. Due to the close proximity to lymphatic tissue and the high frequency of related viral infections, head and neck cancers belong to the most highly infiltrated tumor types. Patients often benefit from immunotherapy, which enhances their own anti-tumor immune response, but further development of efficient strategies is limited by the discovery of novel antibodies and targets. TIL-B cells have been described to deliver novel anti-tumor antibodies in many cancer types but published investigations on head and neck cancers are rare. In the present study, novel antibodies against cancer-related proteins were isolated using the antibody repertoire of TIL-Bs of head and neck cancers. Antibody libraries were constructed based on TIL-Bs isolated from fresh tumor tissue, analysed in next generation sequencing (NGS) and used for phage display. NGS revealed an altered V-gene distribution within the TIL-B libraries compared to published naïve scFv-libraries, which in some characteristics was more similar to the V-gene usage of antigen-experienced B cells. Antibodies against the cancer target matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) were isolated and characterised proving the presence of cancer-related antibodies within the TIL-B repertoire. Furthermore, TIL-B libraries were panned against the pharyngeal carcinoma cell line FaDu. Targets of the cell- binding antibodies were identified by immunoprecipitation and mass spectrometry revealing that nine bound to the cancer-related proteins integrin-a3ß1, CD9 and CD71. Among each other, some of these antibodies showed an identical V-gene recombination and frequent point mutations indicating clonal relation. Characterisation of the isolated antibodies revealed low cross-reactivity and affine binding to their target in various applications including ELISA, immunoprecipitation, flow cytometry and biolayer interferometry. In conclusion, the identification of antibodies against four cancer-related targets from TIL-B libraries demonstrated their vast potential in the discovery of novel anti-tumor antibodies. The observed altered V-gene distribution and the isolation of related, highly mutated antibodies indicate, that they may have contributed to an anti-tumor immune response within the patients. This approach may lead to the identification of novel targets for the development of therapeutic strategies.

Ein Zusammenhang von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) mit einer erhöhten Überlebensrate und verbesserten Prognose wurde für mehrere Krebsarten beschrieben. Durch die Nähe zu lymphatischem Gewebe und einer häufig begleitend auftretenden viralen Infektion, zählen Kopf-Hals-Karzinome zu den am stärksten infiltrierten Tumorarten. Die Patienten profitieren oft von Immuntherapien, die die körpereigene Immunabwehr gegen den Tumor verstärken. Die Entwicklung solcher Therapien ist jedoch durch die Entdeckung neuer Zielproteine und Antikörper limitiert. TIL-B-Zellen wurden in mehreren Krebsarten als Quelle neuer anti-Tumor-Antikörper beschrieben, Untersuchungen von Kopf-Hals-Karzinomen sind jedoch selten. In dieser Arbeit wurden Tumor-assoziierte Antikörper aus dem TIL-B Repertoire von Kopf- Hals-Karzinom-Patienten identifiziert. TIL-Bs wurden aus frischem Tumormaterial isoliert, für die Konstruktion humaner Antikörper-Bibliotheken genutzt und mittels NGS (engl.: next generation sequencing) analysiert. Die TIL-B Bibliotheken wiesen eine veränderte V- Genverteilung auf, die teilweise der von Antigen-erfahrenen B-Zellen gleicht. Um zu bestätigen, dass die TIL-B Bibliotheken Tumor-assoziierte Antikörper enthalten, wurden Antikörper gegen den Tumormarker MMP-9 mittels Phagen Display isoliert und charakterisiert. Weiterhin wurde eine Selektion auf der Pharynx-Karzinom-Zelllinie FaDu durchgeführt. Die Zielproteine der Zell-bindenden Antikörper wurden mittels Immunpräzipitation und Massenspektrometrie identifiziert, wobei neun Antikörper die Tumor- assoziierten Proteine Integrin-a3ß1, CD9 und CD71 banden. Einige der isolierten Antikörper wiesen eine identische V-Genrekombination und eine Vielzahl von Punktmutationen auf, was eine klonale Verbindung vermuten lässt. Die Antikörper banden ihr Zielprotein mit vernachlässigbarer Kreuzreaktivität und hoher Affinität in verschieden Assays einschließlich ELISA, Immunpräzipitation, Durchflusszytometrie und Bio-Layer Interferometrie. Die Identifikation von Antikörpern gegen vier Tumor-assoziierte Proteine aus dem Repertoire von TIL-Bs demonstriert ihr großes Potential in der Entdeckung neuer anti-Tumor Antikörper. Die Beobachtung einer veränderten V-Genverteilung und die Anreicherung stark mutierter Antikörper weisen auf eine potentiell Tumor-induzierte Immunrektion in den betrachteten Patienten hin. Dieser Ansatz könnte zur Identifikation neuer Tumor-selektiver Zielproteine für die Entwicklung therapeutischer Strategien führen.

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Philippi, M., 2020. Discovery of novel therapeutic antibodies and targets using tumor-infiltrating B cells. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-202005181404-0
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