Entwicklung und Charakterisierung von neuartigen glattmuskulären Zellsystemen für die Wirkstoffforschung

Bleisch, Aileen

Zellen der glatten Muskulatur sind überall im menschlichen Körper vorzufinden und übernehmen eine Vielzahl von Funktionen. Ihre Hauptfunktion ist die starke und effiziente Kontraktion. Damit regulieren sie unter anderem die Peristaltik im Magen-Darm-Trakt sowie den Druck in den Gefäßen und Bronchien. Glattmuskelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei pathologischen Erkrankungen wie Asthma, COPD oder Bluthochdruck und besitzen daher einen hohen Stellenwert als Testsysteme für die präklinische Forschung. Für die Entwicklung neuer Wirkstoffe werden Zellsysteme benötigt, die möglichst genau die in-vivo Situation außerhalb des Organismus widerspiegeln. Dafür wurden im Zuge dieser Arbeit mittels der CI-SCREEN Immortalisierung neuartige glattmuskuläre Testsysteme generiert. Neben Glattmuskelzelllinien des Bronchus, der Pulmonalarterie und der Aorta gesunder Spender wurden Atemwegsglattmuskelzelllinien eines COPD Spenders etabliert. Die Analyse der Genintegration und –expression zeigt, dass für die Immortalisierung primärer Glattmuskelzellen die Gene Bmi1, E7, MYC, Nanog und E6 eine wichtige Rolle spielen. Die Aufrechterhaltung des Glattmuskelphänotyps wurde anhand von Genexpressionsanalysen und immunzytochemischen Färbungen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass spezifische Markergene wie α-smooth muscle actin, Sm22-α oder Calponin in den generierten Linien sowie in den primären Zellen kaum exprimiert wurden. Die Expression dieser Gene konnte mittels der Medienzusätze TGF-β1 und B27 deutlich gesteigert werden. Außerdem wurde die Kontraktion der Zelllinien untersucht. Dabei wurde zunächst auf molekularer Ebene die Ausschüttung von Calciumionen nach Histamin-, Serotonin- oder Methacholinstimulation und somit die Expression der entsprechenden GPCRs festgestellt. Der Nachweis der Kontraktion der Zelllinien erfolgte anhand der Besiedelung dezellularisierter Lungenpräzisionsschnitte. Die Anwendung der Zelllinien und deren Potential für die Wirkstoffentwicklung wurde mittels eines klinisch relevanten Medikaments, dem Antihistaminikum Levocetirizin, getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass sich gesunde und erkrankte Glattmuskellinien deutlich unterscheiden und für die Inhibition des Histaminrezeptors gesunder Zellen 10-fach geringere Mengen an Levocetirizin ausreichten, verglichen mit den Zellen des COPD Spenders. Die Daten dieser Arbeit zeigen somit das große Potential der entwickelten Glattmuskelzelllinien als in-vitro Testsysteme für die Wirkstoffentwicklung.

Smooth muscle cells are found throughout the human body and show a variety of functionalities. The most important function is the strong and efficient contraction. Thus, they are able to regulate the peristalsis in the gastrointestinal tract as well as the pressure of the vessels and bronchi. Smooth muscle cells are involved in diseases as asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or hypertension and are important as test systems for preclinical studies. According to the development of new efficacious drugs, in vitro test systems, mimicking the human physiology, are highly desirable. Therefore, the aim of the present study has been the generation of novel and functional smooth muscle cell lines by the CI-SCREEN technology. In addition to smooth muscle cell lines of the bronchus, the pulmonary artery and the aorta of healthy donors, airway smooth muscle cell lines of a COPD donor have been established. The analysis of the integration and expression of the immortalizing genes show that the genes Bmi1, E7, MYC, Nanog and E6 play an important role in the immortalization of primary smooth muscle cells. The maintenance of the smooth muscle phenotype has been investigated by gene expression analysis and immunocytochemistry. It was found that specific marker genes, such as α-smooth muscle actin, calponin or Sm22α, were hardly expressed in the generated cell lines as well as in the primary cells. In order to increase the expression of these genes, various culture conditions have been tested. It turned out that TGF-β1 und B27 significantly increase the expression of smooth muscle specific genes. The usage of a calcium assay revealed the presence of important GPCRs, such as histamine, serotonin, and methacholine receptors, on the surface of the cells. The contraction has been shown by analysing resettled decellularized precision cut lung slices (PCLS). Related to the drug development, the usage of the cell lines has been investigated by a clinically relevant drug, the antihistamine levocetirizine. As result, differences between healthy and diseased smooth muscle cell lines were detected. Consequently, 10-times higher amounts of levocetirizine were necessary to inhibit the histamine receptor of the COPD cells in comparison to the amount for the inhibition of healthy cells. The data of the present study show the enormous potential of the developed smooth muscle cell lines as in vitro test systems for the drug development process.

Cite

Citation style:

Bleisch, Aileen: Entwicklung und Charakterisierung von neuartigen glattmuskulären Zellsystemen für die Wirkstoffforschung. 2020.

Access Statistic

Total:
Downloads:
Abtractviews:
Last 12 Month:
Downloads:
Abtractviews:

show details

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export