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Development of neutralizing and non-neutralizing antibodies targeting known and novel epitopes on Clostridioides difficile Toxin B

Fühner, Viola GND

In this study, antibody phage display technology was used to generate a broad panel of fully human monoclonal antibodies that target TcdB, one of the main virulence factors of Clostridioides difficile and target of new therapeutic approaches. TcdB has a complex domain structure and intoxicates cells via a multistep mechanism, thus offering several weak points which can be addressed with antibodies. Applying different panning strategies against either full TcdB, truncated variants or single domains, 36 unique scFvs were generated of which 31 were further characterized after conversion into the bivalent scFv-Fc format. ELISA and Immunoblot analysis proved TcdB binding and domain specificity of these 31 antibodies analyzed, and confirmed the selection of antibodies with diverse binding characteristics. Using a cell-based in vitro assay, all antibodies were screened for neutralization of TcdB induced cell rounding. Here two antibodies efficiently neutralized TcdB. To test whether in vitro neutralization could be further improved by targeting different domains of TcdB at the same time, antibody combinations were tested in in vitro neutralization of TcdB induced cell rounding. Unfortunately, for the combinations tested in this study, the improvement of neutralization observed was rather of additive than synergistic nature. To gain more information about the binding sites of the antibodies two independent approaches of epitope mapping were followed. With the combination of Peptide array and TcdB-fragment phage display, novel and already described epitopes on TcdB could be identified. By correlating these epitopes with the in vitro neutralization efficacy, a new epitope within the glucosyltransferase domain of TcdB was identified which conveys neutralization. Thus, this study provides valuable information for further development of therapeutics against TcdB. Also, the two potent neutralizing antibodies might be candidates for further preclinical development. Future therapeutic use of these antibodies, preferably as antibody combination with antibodies targeting different domains or epitopes, is easily conceivable due to the human origin of these antibodies.

In dieser Studie wurde die Antikörper-Phagen-Display-Technologie zur Generierung vollständig humaner monoklonaler Antikörper gegen TcdB, einen der wichtigsten Virulenzfaktoren von Clostridioides difficile, eingesetzt. TcdB hat eine komplexe Domänenstruktur und vergiftet Zellen über einen mehrschrittigen Mechanismus. Somit umfasst es mehrere Regionen, an denen Antikörper angreifen können um das Toxin zu neutralisieren. In mehreren Bio-Pannings, entweder gegen das vollständige TcdB, verkürzte Varianten oder einzelne Domänen, wurden 36 einzigartige scFvs generiert, von denen 31 nach Konvertierung in das bivalente scFv-Fc-Format weiter charakterisiert wurden. Mittels Antigen-ELISA und Immunoblot konnte die TcdB-Bindung dieser 31 Antikörper validiert und die Domänenspezifität bestimmt werden. Über einen zellbasierten in vitro Assay wurden die Antikörper auf Neutralisierung der durch TcdB-induzierten Zellrundung untersucht. Zwei der Antikörper neutralisieren TcdB besonders effizient. Durch die simultane Adressierung verschiedener Domänen von TcdB mit Antikörperkombinationen konnte die in vitro Neutralisierung der durch TcdB-induzierten Zellrundung weiter verbessert werden. Die beobachtete Verbesserung der Neutralisierung war allerdings eher auf additive als auf synergistische Effekte zurückzuführen. Des Weiteren wurden zwei unabhängige Ansätze zur Epitop Kartierung der Antikörper verfolgt. Mit der Kombination von Peptid-Array und TcdB-Fragment-Phagen-Display konnten neue sowie bereits beschriebene Epitope auf TcdB identifiziert werden. Durch Korrelation der Epitope mit der Neutralisierungseffizienz der gegen sie gerichteten Antikörper, konnte ein neues Epitop innerhalb der Glucosyltransferase-Domäne identifiziert werden welches Neutralisierung vermittelt. Somit liefert diese Studie wertvolle Informationen für die weitere Entwicklung von Therapeutika gegen TcdB. Auch die beiden potenten neutralisierenden Antikörper sind mögliche Kandidaten für eine weitere präklinische Entwicklung. Ein therapeutischer Einsatz dieser Antikörper, vorzugsweise als Antikörper-Kombination mit Antikörpern, die gegen andere Domänen oder Epitope gerichtet sind, ist aufgrund des menschlichen Ursprungs dieser Antikörper gut vorstellbar.

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