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TIRF-Mikroskopische Untersuchungen der Insulin-Granula und des Aktin-Zytoskeletts in primären Beta-Zellen und Untersuchungen des zellulären Energiestoffwechsels mit PercevalHR

Brüning, Dennis

Bisherige Untersuchungen von Insulin-Granula wurden meist mit dem Fokus auf fusionierende Granula durchgeführt, indem diese manuell gezählt wurden. Das Aktin-Zytoskelett soll bezüglich der Fusion der Granula eine Doppelrolle einnehmen, sowohl als Barriere als auch als Transportstruktur bei Stimulation. Da die Dynamik des Aktins und der Granula energieabhängig sind, ist es außerdem interessant die dynamische ATP/ADP-Ratio in MIN6- und primären Beta-Zellen zu betrachten. In dieser Arbeit wurde das Verhalten der Insulin-Granula in primären Beta-Zellen aus NMRI-Mäusen mittels TIRF-Mikroskopie betrachtet und Anwender-unabhängig ausgewertet. Außerdem wurden Struktur und Lokalisation des Aktin-Zytoskeletts in Abhängigkeit zu den Insulin-Granula untersucht. Die dynamische Änderung der ATP/ADP-Ratio wurde mit dem PercevalHR-Label bestimmt. Die Insulin-Granula in den Beta-Zellen wiesen eine konstante Bewegung vom Zellinneren zur Plasmamembran und zurück ins Zellinnere auf. Auf diese Weise wurde jedes Granulum im Durchschnitt innerhalb von 25 Sekunden 13,3-mal an der Plasmamembran ausgetauscht. Es war überraschend, dass mit einem 30 mM Glucose-Stimulus keine erhöhten Exozytoseraten in den Beta-Zellen beobachtet werden konnten. Allerdings konnte eine sehr hohe Aktin-Dichte an der gesamten Kontaktfläche zum umströmenden Medium beobachtet werden. Parallele Untersuchung der Granula und des Aktin-Zytoskeletts zeigten eine gegenseitig ausschließende Lokalisation beider zellulärer Strukturen, die in vielen Zellen mit steigender Glucose-Konzentration zunahm. Die Messungen der ATP/ADP-Ratio zeigten beim Wechsel von 0 mM Glucose auf 30 mM Glucose, sowohl in MIN6-Zellen als auch in primären Beta-Zellen eine deutliche Steigerung. Es konnte gezeigt werden, dass einzelne Beta-Zelle kein ideales Modell ist um die Exozytose von Insulin-Granula zu untersuchen, da diese nicht mit insulinotropen Stimuli wie 30 mM Glucose gesteigert werden konnte. Ein möglicher Grund dafür könnte das Aktin-Zytoskelett sein, das in Einzelzellen sehr dichte Strukturen an der Zellmembran ausbildet. Diese dichten Aktin-Strukturen könnten die Insulin-Granula von der Plasmamembran abschirmen und die Exozytose verhindern. Es wäre daher von Vorteil die Exozytose von Insulin-Granula an ganzen Inseln untersuchen zu können. Die dynamische ATP/ADP-Ratio ließ sich mit PercevalHR in MIN6-Zellen und in primären Beta-Zellen bestimmen. Der Verlauf der ATP/ADP-Ratio in primären Beta-Zellen besser reproduzierbar.

So far, most of the investigations on Insulin granules focused on granule fusion by manually counting the fusion events. Considering the granule fusion the actin cytoskeleton is believed to act in a dual manner, on one site as a barrier against uncontrolled exocytosis and on the other site as a transport structure in stimulated exocytosis. Since the dynamics of actin and granules are energy-dependent, dynamic measurements of the ATP/ADP-ratio in beta cells are of high interest for these investigations. All measurements were performed in single beta cells. The number and the mobility of insulin granules and the structure and dynamic of the actin cytoskeleton were analysed with TIRF microscopy. The analysis of the insulin granules was performed with an observer-independent program. The dynamic change of the ATP/ADP ratio was measured with the PercevalHR label. In primary beta cells, the insulin granules showed a continuous movement from the centre of cell to the plasma membrane and back into the cell interior. The mean exchange rate of every granule at the plasma membrane was 13.3 times in 25 seconds. Surprisingly stimulation with 30 mM Glucose did not affect the rate of exocytotic events in beta cells. Actually, the density of the cortical actin network was very high, where the beta cells had direct contact to the surrounding medium. Simultaneous investigations of the actin cytoskeleton and the insulin granules revealed a mutually exclusive localisation of actin and granules, which increased in most beta cells with glucose stimulation. The measurements with the indicator PercevalHR showed a strong increase in ATP/ADP-Ratio in both MIN6 cells and primary beta cells, when the glucose concentration was raised from 0 mM to 30 mM. Since the number of exocytotic events did not increase with a 30 mM glucose stimulus primary beta cells are no ideal model system for the investigation of granule exocytosis. The dense structures of the cortical actin network in single beta cells might be an explanation for this behaviour. These dense cortical actin structures might prevent the granules from reaching the plasma membrane and finally from exocytosis. Whole islets would be a favourable model for the measurement of granule exocytosis. The dynamic change of ATP/ADP ratio was successfully measured with PercevalHR in both MIN6 cells and primary beta cells. In these measurements, the results with primary beta cells were more reproducible compared to MIN6 cells.

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