Development of a synthetic sensor system for the detection of infectious and inflammatory signals

Riedel, Jan

Bacterial infections are a major challenge, e.g. upon implant transplantation. Especially the formation of biofilms protects the bacteria from effective treatment. Here, anti-infective treatments needs to be performed early with onset of infection. Inspired by synthetic biological devices this study aimed at engineering a cellular device which can detect infection or inflammation derived signals and transmit these signals to synthetic cassettes. Activation of the type 1 interferon (IFN) system was chosen as a physiological hallmark for viral and bacterial infections as well as a marker for inflammation. To rewire infection related input signals to synthetic cassettes the synthetic doxycycline dependent transactivator gene (tTA) was integrated into the endogenous murine Mx2 chromosomal locus. This locus has been assigned to be specifically induced by type I IFN. Integration of a single copy was performed using CRISPR/Cas9 assisted homologous recombination in murine embryonic stem (mES) cells. Subsequently the IFN signalling was coupled to luciferase expression by integration of a transactivator dependent expression cassette. The engineered ES cells displayed an attenuated IFN response as a consequence of endogenous regulatory mechanisms governing in stem cells. Upon differentiation these cells displayed high induction levels of reporter expression which could be reduced to basal levels by addition of doxycycline even with ongoing IFN signalling being present. Introduction of an autoregulatory circuit could increase the sensitivity without losing the ability of downregulation reporter expression in presence of doxycycline. In an alternative approach the tTA transactivator was integrated into a bacterial artificial chromosome (BAC) vector compromising about 150kb of the cellular Mx2 locus. Stable integration of the modified BAC vector into NIH/3T3 cells displayed a higher sensitivity and an overall higher luciferase expression compared to the single copy as obtained with the CRISPR/Cas9 approach. These systems could detect pathophysiological IFN concentrations in vivo and still preserved their ability to be regulated in presence of doxycycline. Finally, rewiring of infection signals to expression of Il10, an anti-inflammatory cytokine, was achieved. Together, this study represents the proof of concept for the functional rewiring of infectious signals to reporter and anti-inflammatory cues and offers great potential with regard to translational approaches.

Bakterielle Infektionen stellen insbesondere bei der Implantatverwendung eine große medizinische Herausforderung. Innerhalb eines Biofilms sind die Bakterien vor dem Wirkungsmechanismus von Antibiotika geschützt. Um Biofilmformation zu verhindern, müssen Behandlungen zu einem frühen Zeitpunkt einsetzen. Der Fokus dieser Studie lag auf der Etablierung eines zellulären Systems, das infektiöse und inflammatorische Signale wahrnimmt und auf synthetische Expressionskassetten weiterleitet. Hier wurde das Typ 1 Interferon genutzt, das sowohl bei viralen und bakteriellen Infektionen als auch bei inflammatorischen Prozessen induziert wird. Um den durch Interferon aktivierten Signalweg zu synthetischen genetischen Kassetten umzuleiten, wurde das Gen für den Doxycyclin abhängigen synthetischen Transaktivator tTA (Tet-off) mittels homologer Rekombination und CRISPR/Cas9 in den endogenen murinen chromosomalen Mx2 Lokus in embryonalen Stammzellen integriert. In einem weiteren Schritt wurde die Interferon vermittelte Expression des Transaktivators an einen Luciferasereporter gekoppelt. Die synthetischen Kassetten erwiesen sich als funktional und konnten durch Zugabe von Doxycyclin vollständig abgeschaltet werden, selbst in Anwesenheit von Interferon. Die Kopplung mit einem autoregulatorischen Regelkreis zeigte eine Erhöhung der Reporterexpression durch die Amplifikation des Transaktivators, ohne den Doxycyclin abhängigen Regulationsmechanismus zu beeinflussen. In einer anderen Vorgehensweise wurde der Transaktivator in einen ca. 150kb des endogenen Mx2 Lokus umfassenden Bacterial Arificial Chromosome (BAC)-Vektors integriert und stabil in murine NIH/3T3 Fibroblasten eingebracht. Diese Zellen zeigten eine deutlich erhöhte Luciferaseexpression in Anwesenheit von Interferon, vermutlich aufgrund erhöhter Kopienzahlen und damit eine erhöhter Sensitivität. Beide Systeme waren nach Transplantation in die Maus in der Lage pathophysiologische Konzentrationen von Interferon zu detektieren; auch in vivo konnte das Signal mittels Doxycyclin abgeschaltet werden. Schließlich wurde das Signal zur Induktion eines anti-inflammatorischen Zytokins (Il10) eingesetzt. Das funktionelle Umleiten von Infektions-induzierten Signalen auf synthetische Kassetten konnte mittels dieser beiden Systeme erfolgreich umgesetzt werden und eröffnet damit die Möglichkeit neuer therapeutischer Ansätze.

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Riedel, Jan: Development of a synthetic sensor system for the detection of infectious and inflammatory signals. 2019.

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