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Leistungsparameter und Qualifizierungskonzepte für die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie anhand von Bindungskinetiken

Pögel, Franziska

Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Notwendigkeit und Ermöglichung einer Gerätequalifizierung für die Oberflächenplasmonenspektroskopie im Speziellen und für Ligandenbindungsassays im Allgemeinen erörtert. Die unterschiedlichen Richtlinien und Vorgaben verschiedener Gremien für Validierung und Qualifizierung werden kurz vorgestellt, sowie die große Familie der Ligandenbindungsassays. Eine Methode zur Leistungsqualifizierung wurde erarbeitet. Weiterhin werden die Probleme der Datenqualität bei der SPR-Analytik diskutiert, und die Dissoziationskonstante als besonders wichtiger Parameter der Arzneimittelentwicklung für Struktur-Wirkungsbeziehungen und Arzneimittel-Zielstrukturinteraktion präsentiert. Im Fokus dieser Studie stand das Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie-Gerät Biacore X100 von GE Healthcare. Für das Biacore X100 wurde eine umfassende Liste an Leistungsparametern für kinetische Methoden erarbeitet. Dazu wurde eine etablierte Methode zur Messung von Bindungskinetiken des Antigen-Antikörpersystems vom beta-2-Microglobulin verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass dieses System sehr gut für Langzeitmessungen von Bindungskinetiken zur Leistungsqualifizierung des Biacore X100 geeignet ist. Des Weiteren wurden Sensorchips von zwei verschiedenen Herstellern hinsichtlich ihrer Vergleichbarkeit untersucht und eine Standardarbeitsanweisung für eine Leistungsqualifizierung des X100 erarbeitet. Es wurden folgende Parameter in Langzeitmessungen untersucht: die Dissoziationskonstante, die Dissoziationsratenkonstante, die Assoziationsratenkonstante, die Analytenbindungskapazität, die Massentransferkonstante, der Chi-Quadrat, die Summe der Beträge der Residuen und der Brechungsindex. Als besonders effektive Indikatoren für externe und interne Einflüsse zeigten sich die beiden Ratenkonstanten sowie die Analytenbindungskapazität und der Chi-Quadrat. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Analytische Affinitätschromatographie vorgestellt, und zwei Immobilisierungsprotokolle auf 5 mm langen Epoxysilicamonolithen für humanes Serumalbumin überprüft, und damit Bindungsmessungen mit Carbamazepin und die chirale Trennung von D- und L-Tryptophan durchgeführt. Mit dem zweiten weiterentwickelten Immobilisierungsprotokoll konnten D- und L-Trp Basislinien getrennt werden. Die HPAC bedarf noch weiterer Erforschung, da sie noch am Anfang ihrer Entwicklung steht.

The first part of this work is about the necessity of an instrumental performance qualification method and enabling such for surface plasmon resonance spectroscopy in particular and for ligand binding assays in general. Terms of reference and guidance are discussed of different committees for validation and qualification. The differences in some ligand binding assays are presented and some inherent ones are reconsidered. Important parameters like the dissociation constant are discussed for structure activity relationship and drug development. Furthermore, the problems with data quality are highlighted for SPR. A performance qualification method has been established. The main emphasis of this work laid on the surface plasmon resonance spectroscopy instrument Biacore X100. A comprehensive list of performance parameters for kinetic analysis on the Biacore X100 has been provided using a well-established method and long-term measurements. The antigen-antibody system of beta 2 microglobulin was used. Sensor chips of two manufacturers have been investigated in this study and a standard operational procedure was developed for performance qualification. The following parameters have been monitored: dissociation constant, dissociation rate constant, association rate constant, analyte binding capacity, mass transfer constant, chi squared, sum of the absolute values of the residuals and refractive index. As most interesting parameters for external and internal influences have been identified the rate constants, the analyte binding capacity and chi squared. The second part is about analytical affinity chromatography. Two different protocols for immobilization for human serum albumin are discussed on 5 mm long epoxy silica monoliths. These columns were tested with chiral separation of D- and L-tryptophan and for binding studies with carbamazepine. With the second enhanced protocol, the chiral separation was successful. For carbamazepine a value of 538 ± 5,82 µM at 25 °C (literature value: 90,9 µM bei 25 °C ) was determined for dissociation constant. This technique requires further investigation.

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Pögel, F., 2019. Leistungsparameter und Qualifizierungskonzepte für die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie anhand von Bindungskinetiken. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-201907231113-0
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