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Swimming motility of Rhodobacteraceae – Phylogenomic analysis and functional characterization of the archetypal flagellar system in Phaeobacter inhibens DSM 17395

Bartling, Pascal

Many roseobacters exhibit a biphasic ‘swim-or-stick’ lifestyle and need two crucial capacities swimming motility and biofilm formation. Recently, three distinct flagellar geneclusters (FGC) have been identified within the family Rhodobacteraceae (fla1-fla3), of which one was horizontally transferred. Fla1 is the most abundant flagellar system, but the function of four universally conserved proteins (CP1-CP4) remained unclear. The model organism Phaeobacter inhibens DSM 17395 harbors the most abundant fla1-type flagellum and was ideal for an extensive investigation of its FGC. In this thesis a comprehensive phylogeny regarding the flagellar systems of more than 300 completely sequenced Rhodobacteraceae and a phylogenomic reference tree was established. The analyses clearly showed that fla1 is the archetypical FGC of the Rhodobacteraceae. Furthermore, motility assays of 120 Rhodobacteraceae strains revealed functionality of all three FGCs and unraveled a previously unknown type of dendritic motility on MB soft agar plates. Extensive screening of more than 12,000 P. inhibens transposon mutants on soft agar plates resulted in the identification of genes essential for fla1 motility, thereunder CP1 to CP4 and all three genes of the CtrA-phosphorelay. Genetic complementation of these mutants validated their essential function for swimming motility. An exoproteomic detection of flagellar proteins and electron microscopy suggested that CP1 and CP4 still synthesize a complete but static flagellum. CP2 and CP3 lack secreted flagellar proteins, pointing either towards a structural or a regulatory function of the proteins. Analyses of high throughput transcriptome data of the CtrA phosphorelay mutants showed a strong downregulation of chemotaxis and flagellar genes. The comparison of these data with the model organism Dinoroseobacter shibae revealed a core regulon of only 30 genes composed of flagellar genes. These data clearly show the crucial function of the archetypical fla1-type flagellum for Rhodobacteraceae. The most conspicuous motility phenotype among the transposon mutants was developed by a mutant of a novel ECF sigma factor, swimming in concentric rings. Further experiments documented an involvement of the ECF in TDA-biosynthesis and chemotaxis. Overall, this thesis provides the most comprehensive analysis on flagellar motility in Rhodobacteraceae to date and thus essentially contributes towards a deeper understanding of this important bacterial family.

In den Rhodobacteraceae wurden drei verschiedene Flagellensysteme (fla1-fla3) identifiziert. Fla1 ist das häufigste Flagellensystem (FS), aber die Funktion von vier konservierten Proteinen (CP1-CP4) bleibt ungeklärt. Der Modellorganismus Phaeobacter inhibens DSM 17395 hat ein solches fla1 FS und eignete sich für die Untersuchung dieses Systems. In dieser Arbeit wurde eine umfassende Flagellen-Phylogenie von mehr als 300 sequenzierten Rhodobacteraceae erstellt und evolutive Rückschlüsse mit Hilfe eines phylogenomischen Referenzbaums gezogen. Die Analysen ergaben deutlich, dass fla1 das ursprüngliche FS der Rhodobacteraceae ist. Des Weitern wurde die Motilität von 120 Rhodobacteraceae physiologisch auf Weichagar untersucht und erstmals die Funktionalität aller drei FS gezeigt. Dabei wurde eine bisher in den Rhodobacteraceae unbekannte Form dendritischer Motilität entdeckt. Das Screening von mehr als 12000 P. inhibens Transposonmutanten führte zur Identifizierung vieler Gene, die in der Ausprägung von fla1-abhängiger Motilität beteiligt sind, darunter CP1-4 und das CtrA-phosphorelay. Die Komplementierung dieser Mutanten bestätigte ihre Funktion für die Bewegung des Organismus. Flagellen-Proteinnachweise im Exoproteom und Elektronenmikroskopie legten Nahe, dass die Mutanten von CP1 und CP4 ein vollständiges, jedoch unbewegliches Flagellum synthetisieren. Hingegen wurde keine Flagellenproteine in den Mutanten von CP2 und CP3 identifiziert, so dass eine regulatorische oder strukturelle Funktion für diese Proteine wahrscheinlich erscheint. Transkriptomanalysen an Mutanten des CtrA- Phosphorelays zeigten unter anderem eine starke Herunterregulation der Flagellen- und Chemotaxisgene und der Vergleich mit dem Regulon aus Dinoroseobacter shibae ergab eine regulatorische Überlappung von etwa 30 Genen, welche in die Biosynthese des Flagellums involviert sind. Diese Daten belegen deutlich die Rolle des CtrA-Phosphorelays in der Regulation des archetypischen fla1 Flagellums. Der auffälligste Phänotyp unter den Transposonmutanten wurde durch die Mutagenese eines neuen ECF Sigmafaktors erzeugt. Die Mutante schwamm in voneinander abgegrenzten, konzentrischen Kreisen. Weitere Experimente deuten auf eine Beteiligung des Sigmafaktors an der TDA-Biosynthese und Chemotaxis hin. Zusammenfassend liefert diese Arbeit die bisher umfassenste Analyse der Motilität der Rhodobacteraceae und trägt damit wesentlich zum Vertändis dieser ökologisch bedeutsamen Gruppe von Bakterien bei.

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Bartling, P., 2019. Swimming motility of Rhodobacteraceae – Phylogenomic analysis and functional characterization of the archetypal flagellar system in Phaeobacter inhibens DSM 17395. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-201907231058-0
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