Entwicklung eines Massenspektrometrie-basierten Verfahrens zur Quantifizierung von HIV-Strukturproteinen und deren Stöchiometrie für neue analytische Anwendungen

Luckau, Luise

In der Virusdiagnostik und -forschung ist die Verfügbarkeit von genau charakterisierten viralen Referenzmaterialien von Bedeutung, da sie vor allem die Messgenauigkeit verbessern. Ein Ziel ist die genaue Quantifizierung der für den Aufbau von Viren relevanter Biomoleküle, der viralen Nukleinsäure, der funktionalen viralen Proteine, sowie deren Verhältnisse. Die derzeit metrologisch genauesten Methoden im Bereich der Nukleinsäure-Quantifizierung ist die digitale PCR (z. B. droplet digital PCR: ddPCR) und in der Protein-Quantifizierung die Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie (IDMS). Beide Verfahren wurden für die HIV-Quantifizierung auf ein in vitro hergestelltes Virusmaterial angewendet. Bei dem direkten Vergleich beider Methoden bezüglich der Wiederholbarkeit von Messungen erreichte die ddPCR eine technische Präzision von ± 0,7 % und die IDMS von ± 2,5 %. Dagegen konnte mit der IDMS aufgrund der internen Standardisierung mit ± 2 % eine bessere Reproduzier¬barkeit der Komplettanalysen im Vergleich zur ddPCR mit ± 3,8 % erzielt werden. Auf der Basis von ersten Peptide-Mapping-Analysen des HIV-Materials wurde das IDMS-Verfahren bezüglich der Quantifizierung des Gag-Polyproteins (GAGp55) etabliert, das als Vorläuferprotein alle viralen Strukturproteine Matrix (MAp17)-, Capsid (CAp24)- und p6-Protein enthält. Das gefundene Mengenverhältnis von MAp17, CAp24 und p6 weicht vom erwarteten äquimolaren Verhältnis ab, was auf alterna¬tive Translations¬mechanismen rückzuführen ist. Aufgrund eines IRES (internal ribosomal entry site) -abhängigen Translationsmechanismus können MAp17-trunkierte Gag-Proteinvarianten entste¬hen, weshalb die MAp17-Menge im Vergleich zu CAp24 um ~20 % reduziert ist. Die Ursache für um ~30 % reduziertes p6 im Vergleich zu CAp24 ist womöglich ein RNA-Sequenzmotiv, das bekannterweise die ribosomale Leserahmenverschiebung für die Gag-Pol-Synthese ver¬ursacht. Da die Quantifizierung von Viren als komplexe Strukturen eine Herausforderung darstellt, auch bezüglich der Verwendung des Quantifizierungsstandards, wurde ein Lysin- und Arginin-isotopenmarkiertes HIV-Material mittels SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) hergestellt, das chemisch genauso aufgebaut ist wie das natürliche HIV-Material. Dieses Material kann nach umfassender Charakterisierung in Zukunft für die relative und absolute Quantifizierung eingesetzt werden.

The availability of well characterized viral reference materials is of great importance for the estimation of viral load and for scientific issues. Such materials greatly improve measurement accuracy. The aim of this work is the accurate quantification and the determination of the stoichiometric ratio of all viral biomacromolecules. These are relevant for viral composition and consist of the viral nucleic acid and the functional viral proteins. To date, the most accurate measurement methods in the fields of nucleic acid and protein quantification are droplet digital PCR (ddPCR) and isotope dilution mass spectrometry (IDMS), respectively. Both methods were used for the quantification of HIV in an in vitro produced viral material. The direct comparison of both methods, regarding the repeatability of measurements, demonstrated a technical precision of ± 0.7 % for ddPCR and of ± 2.5 % for IDMS. In contrast, IDMS could reach a higher reproducibility, due to its incorporation of an internal standard, with ± 2 % compared to ± 3.8 % when using ddPCR. Based on first peptide mapping analyses of the HIV material, an IDMS approach was developed for the quantification of the Gag polyprotein precursor (GAGp55), which included all structural protein components matrix (MAp17), capsid (CAp24) and p6. The quantified stoichiometry of the GAGp55 derived structural proteins MAp17, CAp24 and p6 differ from the expected equimolar ratios due to alternative translation mechanisms. Based on an IRES- (internal ribosomal entry site) dependent trans¬lation mechanism, a MAp17 truncated Gag protein can be produced resulting in a reduction of ~20 % in the amount of MAp17 compared to CAp24. The observation of a ~30 % reduction in the amount of p6 compared to CAp24 is likely a result of an RNA sequence motif, which is known to cause the programmed ribosomal frameshift resulting in Gag-Pol synthesis. The quantification of biomolecular assemblies, such as a virus, via their complex biomolecular structures, in complex matrices also provides a great challenge in the selection and use of an ideal calibration standard. To address this, a labeled virus material, in which every lysine and arginine amino acid in the virus proteins were isotopically labelled, was prepared by SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture). This material was chemically equivalent to the natural material and if fully characterized can be used for relative and absolute quantification approaches.

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Luckau, Luise: Entwicklung eines Massenspektrometrie-basierten Verfahrens zur Quantifizierung von HIV-Strukturproteinen und deren Stöchiometrie für neue analytische Anwendungen. 2019.

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