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Molecular Cloning and Functional Characterization of Benzophenone Synthases from Centaurium erythraea and Swertia chirata (Gentianaceae)

Ali, Rabeia

Centaurium erythraea, Swertia chirata, and Gentiana lutea are medicinal plants belonging to the Gentianaceae family. They serve as major sources of important secondary metabolites, xanthones and amarogentin. Xanthones have been termed as ‘privileged structures ’ owing to diverse pharmacological benefits. The biosynthesis pathway of xanthones has been extensively studied in cell cultures of C. erythraea. The basic step is formation of a tetraketide intermediate, which is catalyzed by benzophenone synthase (BPS). BPS preferred 3-hydroxybenzoyl-CoA as starter substrate and catalyzed three iterative condensations with malonyl-CoA, followed by a Claisen-type ring closure C6 to C1 to form 2,3՝ ,4,6-tetrahydroxybenzophenone (2,3՝ ,4,6-THB). In the present work, a cDNA encoding BPS was cloned from cell cultures of C. erythraea. It contained an OFR of 1170 bp. In addition, a new cDNA encoding BPS was cloned in our laboratory from root cultures of S. chirata, which had an OFR of 1179 bp. The sequences shared 80.8 % identity at the protein level. They were expressed in E. coli as N-terminally His -tagged proteins, which were 6 purified and functionally characterized. Notably, both enzymes preferred 3-((3-hydroxybenzoyl)-oxy)benzoyl-CoA as potential starter substrate, followed by 3-((3-hydroxybenzoyl)-3- hydroxybenzyol)-oxy)benzoyl-CoA and 3-hydroxybenzoyl-CoA. With the three related CoA esters, the product was identical, i.e. 2,3՝ ,4,6-THB. The enzymes also used benzoyl-CoA and cinnamoyl-CoA as starter molecules and formed 2,4,6-THB and styrylpyrone, respectively. Unlike xanthones, amarogentin is a secoiridoid glycoside. It is the bitterest natural product isolated to date. Recently, interesting novel pharmacological activities have been found, such as inhibition of DNA topoisomerase I in Leishmania donovani. This was motivation to study the biosynthesis pathway of amarogentin, which was proposed previously to be a polyketide pathway. One molecule of 3-hydroxybenzoyl-CoA and three molecules of malonyl-CoA seem to be converted by biphenylcarboxylate synthase (BICS). Here, a full-length gene (GL_put BICS) from G. lutea was cloned, which contained an ORF of 1170 bp. However, the encoded protein failed to show any activity.

Centaurium erythraea, Swertia chirata und Gentiana lutea sind Arzneipflanzen aus der Familie der Gentianaceae. Sie dienen als Hauptquelle bedeutender Sekundärmetabolite, Xanthone und Amarogentin. Xanthone wurden aufgrund verschiedener pharmakologischer Aktivitäten als "privilegierte Strukturen" bezeichnet. Der Biosyntheseweg von Xanthonen wurde schon ausführlich in Zellkulturen von C. erythraea untersucht. Die Bildung einer Tetraketid-Zwischenstufe wird durch die Benzophenon-Synthase (BPS) katalysiert. BPS bevorzugt 3-Hydroxybenzoyl-CoA als Startersubstrat und katalysiert drei iterative Kondensationen mit Malonyl-CoA, gefolgt von einem Claisen-Ringschluss C6 zu C1, um 2,3՝,4,6-Tetrahydroxybenzophenon (2,3,4,6-THB) zu bilden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine cDNA kloniert, die für BPS aus Zellkulturen von C. erythraea kodiert und einen OFR von 1170 bp enthält. Darüber hinaus wurde in unserem Labor eine neue cDNA aus Wurzelkulturen von S. chirata kloniert, die einen OFR von 1179 bp enthält und ebenfalls für BPS kodiert. Die Sequenzen sind auf Proteinebene zu 80,8% identisch. Sie wurden in E. coli als N-terminale His -markierte Proteine 6 exprimiert, welche dann gereinigt und funktionell charakterisiert wurden. Bemerkenswerterweise bevorzugten beide Enzyme 3-((3-Hydroxybenzoyl)-oxy)benzoyl-CoA als Startersubstrat, gefolgt von 3- ((3-Hydroxybenzoyl)-3-hydroxybenzyol)-oxy)benzoyl-CoA und 3-Hydroxybenzoyl-CoA. Mit allen drei verwandten CoA-Estern war das Produkt identisch, nämlich 2,3՝,4,6-THB. Daneben verwendeten die Enzyme auch Benzoyl-CoA und Cinnamoyl-CoA als Startermoleküle und bildeten 2,4,6- Trihydroxybenzophenon bzw. Styrylpyron. Anders als Xanthone ist Amarogentin ein Secoiridoid- Glykosid und der bitterste Naturstoff. Kürzlich zeigte er interessante neue pharmakologische Aktivitäten, z.B. die Hemmung der DNA-Topoisomerase I von Leishmania donovani . Dies war eine Motivation, den Biosyntheseweg von Amarogentin zu untersuchen. Früher vorgeschlagen war ein Polyketidweg. Ein Molekül 3-Hydroxybenzoyl-CoA und drei Moleküle Malonyl-CoA werden durch die Biphenylcarboxylat-Synthase (BICS) umgesetzt. Es gelang, das Volllänge-Gen GL_put BICS aus G. lutea zu klonieren, das einen ORF von 1170 bp enthält. Aber das kodierte Protein zeigte keine Aktivität.

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Ali, R., 2019. Molecular Cloning and Functional Characterization of Benzophenone Synthases from Centaurium erythraea and Swertia chirata (Gentianaceae). https://doi.org/10.24355/dbbs.084-201906271140-0
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