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ER intrabody mediated protein knockdown in zebrafish

Russo, Giulio ORCID

Gene knockout and knockdown approaches have been extensively used in zebrafish to study genes playing a pivotal role during the development, or to create animal models of human diseases. In the past ten years, evidence has accumulated that using different loss-of-function methods, acting at DNA or RNA level to interfere with the expression of a specific gene may often result in the generation of completely independent phenotypes. Genetic compensation on one side and off-targeting effects on the other have been identified as main contributors to this phenomenon. The ER intrabody knockdown approach, acting at protein level with high specificity, is intrinsically less prone to such drawbacks, and additionally offers a higher level of protein isoform discrimination. In this study, we describe the process of antibody validation for highly specific protein identification in different assays and for targeted protein knockdown in vitro and in vivo of zebrafish Cadherin-2 (Cdh2). We have generated 11 novel sequence-defined human scFv antibodies against zebrafish Cdh2 via phage display. Cdh2 parachute mutant and Cdh2-GFP transgenic lines were used to compare antibody specificity in immunofluorescent staining and flow cytometry analysis, as well as whole mount immunohistochemistry. Four of these recombinant monoclonal antibodies showed drastically improved specificity against zCdh2 compared to the only commercial available reagent, which was found highly cross-reactive towards zCdh2-- cells, independently from the type of sample preparation. Further, we generated ER intrabodies to zCdh2 via genetically fusing the newly generated scFv antibody genes to the DNA encoding for the ER localization KDEL peptide. We evaluated ER intrabodies‘ capability to mediate zCdh2 knockdown from the surface of PAC2 cells and to induce target antigen degradation. In vivo, the ER intrabody SH1352-D7-KDEL expressed in atoh1a+ progenitors of zebrafish embryos was shown to interfere with tegmental hindbrain nuclei primordia formation. Our validated protein knockdown approach constitutes an expansion of the available zebrafish tool box for gene function studies and for modeling human diseases in this organism model. We indirectly proved that protein based approaches can have a beneficial impact on the zebrafish community, provided that the process of generation of these tools is subjected to an extensive and thoughtful characterization processes.

Gen-Knockout- und Knockdown-Ansätze werden in Zebrafischen umfassend eingesetzt, um Gene zu untersuchen, die während der Entwicklung eine zentrale Rolle spielen, oder um Tiermodelle für menschliche Krankheiten zu erstellen. In den letzten zehn Jahren hat sich gezeigt, dass die Verwendung verschiedener Funktionsverlustmethoden, die auf DNA- oder RNA-Ebene wirken, um die Expression eines bestimmten Gens zu stören, oft zur Erzeugung völlig unabhängiger Phänotypen führen kann. Genetische Kompensation einerseits und Off-Targeting-Effekte andererseits wurden als Hauptursachen für dieses Phänomen identifiziert. Der ER Intrabody Knockdown-Ansatz, der auf Proteinebene mit hoher Spezifität agiert, ist an sich weniger anfällig für solche Nachteile und bietet zusätzlich eine höhere Ebene des Unterscheidungspotenzials bei Proteinisoformen. In dieser Studie beschreiben wir den Prozess der Antikörpervalidierung zur hochspezifischen Proteinidentifikation in verschiedenen Assays und zum gezielten Proteinabbau in vitro und in vivo von Zebrafisch Cadherin-2 (Cdh2). Wir haben 11 neuartige, sequenzdefinierte humane scFv-Antikörper gegen Zebrafisch Cdh2 mittels Phagen-Display generiert. Transgene Linien mit einer Cdh2 Parachute-Mutante bzw. Cdh2-GFP wurden verwendet, um die Antikörperspezifitäten in der immunfluoreszierenden Färbe- und Durchflusszytometrieanalyse, und der Immunhistochemie von whole-mount-Montagen zu vergleichen. Vier unserer rekombinanten monoklonalen Antikörper zeigten eine deutlich verbesserte Spezifität gegen zCdh2 im Vergleich zu dem einzigen kommerziell erhältlichen Reagenz, das unabhängig von der Art der Probenvorbereitung eine hohe Kreuzreaktivität gegenüber zCdh2---Zellen zeigte. Außerdem generierten wir ER-Intrakörper gegen zCdh2 durch genetische Fusion der neu generierten scFv-Antikörpergene mit DNA, die für das ER-Lokalisierungs-Peptid KDEL kodiert. Wir untersuchten die Fähigkeit dieser Antikörper, den zCdh2-Knockdown von der Oberfläche der PAC2-Zellen zu vermitteln und den Abbau des Antigens zu induzieren. In vivo konnte gezeigt werden, dass der ER-Intrakörper SH1352-D7-KDEL, der in atoh1a+-Vorläufern von Zebrafischembryonen exprimiert wurde, die Bildung tegmenteller Hinterhirnkerne nuclei primordia stört. Unser validierter Protein-Knockdown-Ansatz stellt eine Erweiterung der verfügbaren Zebrafisch-Toolbox für Genfunktionsstudien und zur Modellierung menschlicher Krankheiten in diesem Organismusmodell dar. Wir haben indirekt bewiesen, dass proteinbasierte Ansätze einen positiven Einfluss auf die Zebrafisch-Forschungsgemeinschaft haben können, vorausgesetzt, dass der Prozess der Generierung dieser Werkzeuge einem umfangreichen und durchdachten Charakterisierungsprozess unterzogen wird.

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Russo, G., 2019. ER intrabody mediated protein knockdown in zebrafish. https://doi.org/10.24355/dbbs.084-201906171234-0
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