Mutation and/or inactivation of actin regulatory genes relevant for infection using the CRISPR/Cas system in tissue cultured cells

Kollasser, Jana

The Arp2/3 complex is a key regulator of the actin cytoskeleton that nucleates branched actin filament networks. However, the nucleation core activity of Arp2/3 is weak by itself and needs to be activated by nucleation promoting factors (NPFs) from the Wiskott-Aldrich Syndrome family. Several NPFs have been identified and can be divided into the two subclasses type I NPFs as well as type II NPFs. Type I NPFs include WASH, WHAMM, and JMY, among others. Importantly, bacterial pathogens can manipulate processes involved in actin rearrangements to survive within host cells and even enforce their uptake. Of particular interest for this study was the connection between actin assemblies on endomembranes and the intracellular lifestyle of pathogenic invaders. Here, I addressed the inactivation of WASH, WHAMM, and JMY that are at play in endomembrane traffic by using the CRISPR/Cas9 technology. Upon somatic gene knockout of these actin regulators, I examined a broad set of cellular and infection processes in murine fibroblasts and human cancer cells. To this end, I have generated several independent clones of NIH/3T3 fibroblasts lacking functional genes of WASH, WHAMM, and JMY. All cell lines were probed for the absence of the respective proteins by western blotting and targeted loci of clones lacking protein expression were genomically sequenced. The cellular phenotypes of obtained knockout cell lines have been characterized with special emphasis on ER- and Golgi morphology as well as on autophagy. WHAMM knockout significantly alters NIH/3T3 morphology, in particular WHAMM-deficient cells exhibited enlarged cell size and nuclear area and displayed higher granularity. In addition, knockout of WHAMM significantly affects integrity of the Golgi apparatus. Microarray analyses revealed a deregulation of genes encoding for enzymes involved in cholesterol biosynthesis as well as of genes being crucial for the adhesion pattern in WHAMM KO clones. Notably, examination of autophagy uncovers significantly higher numbers of LC3-, p62-, and LAMP1-positive vesicles as well as displayed enlarged omegasomes, autophagosomes, and lysosomes in knockout NIH/3T3 cells. Lastly, it could be shown that ablation of WHAMM decreases the infection rate of VSV and HSV-1. Current experiments are designed to unravel potential functions of WHAMM and its relatives in autophagy in more detail and to explore potential membrane alterations by both super-resolution and electron microscopy.

Der Arp2/3-Komplex ist ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskeletts, der verzweigte Aktinfilament-Netzwerke ausbildet. Der Komplex ist weitgehend inaktiv und es bedarf einer Aktivierung durch Nucleation Promoting Factors (NPFs). NPFs lassen sich in zwei Unterklassen einteilen: Typ I NPFs sowie Typ II NPFs. Typ I NPFs umfassen unter anderem WASH, WHAMM und JMY. Maßgeblich sind Pathogene in der Lage, Prozesse, die eine Aktinreorganisation erfordern, zu manipulieren, um in der Wirtzelle zu überleben oder sogar ihre eigene Aufnahme zu erwingen. Vom besonderen Interesse für diese Arbeit war der Zusammenhang zwischen Aktinassemblierung an Endomembranen sowie dem intrazellulären Lifestyle von Pathogenen. WASH, WHAMM und JMY, die im Endomembranenverkehr eine Rolle spielen, wurden durch die CRISPR/Cas9 Technologie inaktiviert. Nachdem diese Aktinregulatoren somatisch ausgeschaltet wurden, untersuchte ich eine Vielzahl von zellulären Prozessen sowohl in murinen Fibroblasten als auch in humanen Krebszellen. Ich generierte mehrere unabhängige NIH/3T3 Fibroblasten-Klone, denen die funktionellen Gene von WASH, WHAMM und JMY fehlten. Alle Zelllinien wurden via Western Blot auf die Abwesenheit der jeweiligen Proteine überprüft und bei fehlender Proteinexpression genomisch sequenziert. Die zellulären Phänotypen der erhaltenen Knockout-Zelllinien wurden besonders hinsichtlich ihrer ER- und Golgi-Morphologie sowie Autophagie charakterisiert. WHAMM-Knockout verändert maßgeblich die Morphologie von NIH/3T3-Zellen, insbesondere zeigten WHAMM-defiziente Zellen eine vergrößerte Zell- und Zellkerngröße sowie eine erhöhte Granularität. Darüber hinaus beeinflusst das Fehlen von WHAMM die Integrität des Golgi-Apparats. Microarray-Analysen zeigten eine Deregulierung von Genen, die für an der Cholesterinbiosynthese beteiligten Enzyme kodieren sowie von Genen, die für das Adhäsionsmuster in WHAMM Knockout-Klonen von Bedeutung sind. Insbesondere eine Überprüfung der Autophagie deutete auf eine Vielzahl von LC3-, p62- sowie LAMP1-positiven Vesikeln hin und zeigten vergrößerte Omegasomen, Autophagosomen und Lysosomen in NIH/3T3-Knockout-Zellen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass das Fehlen von WHAMM die Infektionsrate von VSV und HSV-1 verringert. Aktuelle Experimente befassen sich mit detaillierten Funktionen von WHAMM und seinen Verwandten im Autophagieprozess und mit der Untersuchung möglicher Membranveränderungen durch Super-Resolution- sowie Elektronenmikroskopie.

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Kollasser, Jana: Mutation and/or inactivation of actin regulatory genes relevant for infection using the CRISPR/Cas system in tissue cultured cells. 2019.

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