Role of the Alpha-1 Subunit of the Na+, K+-ATPase (ATP1A1) in the Macropinocytic Entry of Respiratory Syncytial Virus, and Development of a Live-Attenuated Vaccine against Ebola Virus

Lingemann, Matthias

Human respiratory syncytial virus (RSV) is the leading viral cause of severe bronchiolitis and pneumonia in infants and young children worldwide. To gain insight into virus-host interactions, a genome-wide siRNA screen was performed in human airway epithelial A549 cells that were infected with RSV expressing GFP. Knockdown of expression of the cellular ATP1A1 protein had the strongest inhibitory effect on GFP expression and viral titer. This inhibitory effect was not observed for vesicular stomatitis virus (VSV), indicating that it was RSV-specific. It was found that RSV induced the formation of ATP1A1 clusters in the plasma membrane of the host cell very early during infection. RSV infection also triggered ATP1A1-mediated signaling, involving c-Src activation that resulted in the transactivation of EGFR by Tyrosine 845 phosphorylation. Further signaling events downstream of EGFR culminated in the formation of macropinosomes. In addition, this study identified chemical compounds (Ouabain and PST2238), which bind to ATP1A1, that inhibited RSV-induced signaling and resulted in the inhibition of RSV entry. Taken together, this study describes a novel ATP1A1-enabled mechanism used by RSV to enter the host cell, and identified candidate antiviral drugs that block this entry pathway. The second part describes the development and preclinical evaluation of a live-attenuated human parainfluenza virus type 1 (HPIV1)-vectored vaccine against Ebola virus (EBOV). EBOV glycoprotein GP was expressed either as a full-length protein or an engineered chimeric form in which its transmembrane and cytoplasmic tail (TMCT) domains were substituted with those of the HPIV1 F protein. GP was inserted at two different positions (pre-N or between the N and P genes) of the attenuated HPIV1 genome. The viral constructs grew to high titers and efficiently and stably expressed GP in vitro. All viruses showed the expected attenuation in the respiratory tract of African green monkeys. Two doses of candidates expressing GP from the pre-N position elicited higher GP neutralizing serum antibody titers than the N-P viruses, and expression of unmodified GP resulted in higher levels than its chimeric TMCT counterpart. The TMCT modification did not increase packaging or immunogenicity but rather reduced the stability of GP expression during in vivo replication. In conclusion, this study developed an attenuated and immunogenic intranasal vaccine candidate and is available for clinical evaluation.

Das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) ist der bedeutendste virale Erreger von Bronchiolitiden und Pneumonien bei Säuglingen. Um ein besseres Verständnis der Virus-Wirts-Interaktionen zu erlangen, wurde eine genomweite Untersuchung mittels siRNA-Knockdown in A549 Zellen durchgeführt, die mit RSV, welches GFP exprimierte, infiziert wurden. Die Verringerung der zellulären Expression von ATP1A1 hatte den stärksten Effekt auf die RSV-Replikation. Sehr früh während der Infektion kam es zur Bildung von ATP1A1-Aggregaten in der Plasmamembran der Wirtszelle. Mechanistisch induzierte RSV eine ATP1A1-abhängige Signaltransduktion, welche zur Aktivierung der zellulären Src-Kinase und infolge dessen zur Transaktivierung von EGFR durch die Phosphorylierung von Tyrosin 845 führte. Die Aktivierung der EGFR-abhängigen Signalkaskade induzierte die Bildung von Makropinosomen, die RSV enthielten. Darüber hinaus wurden zwei antiviral wirkende Verbindungen (Ouabain und PST2238) identifiziert, die spezifisch an ATP1A1 binden und die RSV-induzierten ATP1A1-Signalkaskade und folglich den RSV-Eintritt hemmten. Zusammenfassend wurde ein neuer ATP1A1-abhängigen Signalweg charakterisiert, der von RSV aktiviert wird, und potentielle antivirale Medikamente, die diesen inhibieren. Der zweite Teil beschreibt die Entwicklung und präklinische Evaluation eines attenuierten humanen Parainfluenzavirus Typ 1 (HPIV1) basierenden Lebendimpfstoff gegen das Ebolavirus (EBOV). Das EBOV GP-Protein wurde entweder als unveränderte oder als chimäre Form, in der die Transmembran- und zytoplasmatische- (TMCT-) Domäne des GP-Proteins durch die des HPIV1 F-Proteins ersetzt war, exprimiert. Das GP-Gen wurde in zwei verschiedene Positionen (pre-N oder zwischen dem N- und P-Gen) eines rekombinanten HPIV1-Genoms eingefügt. Die In-Vivo-Vermehrung aller Viren war attenuiert und die zweimalige Immunisierung mit den Impfstoffkandidaten, die das GP-Gen von der pre-N Position exprimierten, induzierten höhere GP-neutralisierende Serumantikörpertiter als die Viren mit dem GP-Gen in der N-P Position. Die Expression des unveränderten GP-Proteins induzierte höhere Antikörpertiter als die des chimären TMCT-Konstrukts. Dahingegen beeinflusste die TMCT-Modifikation weder die Verpackung noch die Immunogenität positiv, sondern reduzierte die Stabilität der GP-Expression in vivo. Zusammenfassend wurde ein attenuierter und immunogener intranasaler Impfstoffkandidat identifiziert, der für klinische Studien zur Verfügung steht.

Cite

Citation style:

Lingemann, Matthias: Role of the Alpha-1 Subunit of the Na+, K+-ATPase (ATP1A1) in the Macropinocytic Entry of Respiratory Syncytial Virus, and Development of a Live-Attenuated Vaccine against Ebola Virus. 2019.

Access Statistic

Total:
Downloads:
Abtractviews:
Last 12 Month:
Downloads:
Abtractviews:

show details

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export