Development of recombinant human anti-diphtheria toxin neutralizing antibodies for diphtheria therapy

Wenzel, Esther Veronika

Diphtheria is an infectious disease caused by toxigenic Corynebacterium spp. that produce diphtheria toxin (DT). Diphtheria is a significant health problem in countries with poor immunization coverage or disrupted immunization programs. Even in countries where the disease is well controlled, there is a need to maintain a stockpile of therapeutic diphtheria antitoxin (DAT) for management of sporadic or imported cases. Currently, diphtheria is still treated with equine sera in the same way it was treated more than 100 years ago by Emil von Behring. Antibodies against DT have been generated from immune and naive human antibody gene libraries by phage display. The panning was performed on unnicked DT once classically with DT immobilized on a microtiterplate and once with biotinylated-DT in panning in solution. Among both panning strategies, 660 monoclonal antibodies were selected. The first screening was either for binding of the antibodies against diphtheria toxin or for neutralization of diphtheria toxin in a cell-based assay. In total, 439 antibodies were further characterized in scFv-Fc format regarding neutralization in a cell-based in vitro neutralization assay. In this assay, 290 scFv-Fc antibodies showed neutralization potency. The best 35 neutralizing scFv-Fc were sub-cloned into IgG1 format. Three best neutralizing lead candidates were selected, one against each of the three domains of DT. The IgG targeting the receptor binding domain is ewe372-D4 and has a neutralization potency of 446 IU/mg. ewe375-H4 has a neutralization potency of 20.4 IU/mg and binds the catalytic domain and ewe372-F6 binds the translocation domain with a neutralization potency of 2.25 IU/mg. In comparison, neutralization potency of equine DAT is approximately 50 IU/mg. In this study, seven antibodies with a higher neutralization potency then equine DAT were developed, and they all bind the receptor binding domain of diphtheria toxin. In the next step, experiments in a non-lethal guinea pig model were conducted to test in vivo protection potency. Possible prospects include further development and testing of these antibodies for clinical application as therapeutic agents against diphtheria toxin.

Diphtherie ist eine Infektionskrankheit, die durch Corynebacterium spp. verursacht wird, die das Diphtherie Toxin (DT) produzieren. Diphtherie ist ein großes Gesundheitsproblem in Ländern mit schlechter Impfrate oder beeinträchtigten Impfprogrammen. Selbst in Ländern, in denen die Krankheit gut kontrolliert wird, ist es notwendig, einen Vorrat an therapeutischem Diphtherie-Antitoxin (DAT) für die Behandlung von sporadisch auftretenden oder importierten Fällen zu halten. Diphtherie wird heutzutage immer noch mit Pferdeseren behandelt, wie es vor mehr als 100 Jahren von Emil von Behring entwickelt wurde. In dieser Arbeit wurden Antikörper gegen DT aus immun- und naiven- menschlichen Antikörpergenbibliotheken durch Phagen Display erzeugt. Das Panning wurde an nativem DT einmal klassisch mit immobilisiertem DT in einer Mikrotiterplatte und einmal mit biotinyliertem DT mit Panning in Lösung durchgeführt. Insgesamt wurden 660 monoklonale Antikörper selektiert. Das erste Screening erfolgte entweder zur Bindung der Antikörper gegen DT oder zur Neutralisierung von DT in einem zell-basierten Assay. Insgesamt wurden 439 Antikörper im scFv-Fc-Format hinsichtlich der Neutralisation in einem zell-basierten in vitro Neutralisationstest weiter charakterisiert. In diesem Assay zeigten 290 scFv-Fc-Antikörper eine Neutralisation. Die besten 35 neutralisierenden scFv-Fc wurden in das IgG1-Format kloniert. Es wurden die drei best neutralisierendsten Kandidaten ausgewählt, einer gegen jede der drei Domänen von DT. Der Antikörper ewe372-D4 bindet an die Rezeptorbindungsdomäne und neutralisiert mit 446 IU/mg. ewe375-H4 bindet die katalytische Domäne und neutralisiert mit 20,4 IU/mg und ewe372-F6 neutralisiert durch Bindung an die Translokationsdomäne mit 2,25 IU/mg. Das polyklonale DAT (Pferdeserum) neutralisiert mit ca. 50 IU/mg. In dieser Studie wurden sieben Antikörper mit einer höheren Neutralisationsrate als Pferde-DAT entwickelt, die alle die Rezeptorbindungsdomäne des Diphtherie Toxins binden. Anschließend folgen Experimente in einem nicht tödlichen Meerschweinchen Modell, um die Protektion in vivo zu testen. Die aus dieser Studie stammenden Antikörper können für die klinische Anwendung als Therapie gegen Diphtherie weiterentwickelt werden.

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Wenzel, Esther: Development of recombinant human anti-diphtheria toxin neutralizing antibodies for diphtheria therapy. 2019.

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