Entwicklung einer API-Produktionsplattform mittels CRISPR/Cas9 auf Basis einer CHO Zelllinie

Schröder, Simon

Der Markt monoklonaler Antikörper (mAb) ist in Bezug auf Vielfalt und Produktionsmenge in den letzten Jahren stark gewachsen [1]. Um die daraus resultierende steigende Nachfrage nach mAbs bedienen zu können, ist es notwendig gute Produktionsplattformen, die den qualitativen Ansprüchen in ausreichender Quantität gerecht werden, für den Markt bereit zu stellen [2]. Diese Dissertation zeigt, wie mit Hilfe der clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) Methode, durch Ausschalten eines Gens der Wirtzelle, eine Produktionsplattform generiert werden kann, mit der es möglich ist therapeutische Proteine in guter Qualität und ausreichender Quantität herzustellen. Die Produktionsleistung der aus dieser Plattform entstandenen Zelllinien kann durch Zugabe von Methotrexat (MTX), einem reversiblen Inhibitor des Enzyms Dihydrofolatreduktase (DHFR), zu dem Zellkulturmedium, gesteigert werden. Die erreichten Produktivitäten der entstandenen Zellklone bewegten sich dabei im dreistelligen Milligramm-Bereich. Die der Produktionsplattform zugrundeliegende Zelllinie wurde genetisch durch den Einsatz der CRISPR-Cas9-Methode so verändert, dass sie nicht in der Lage ist das Enzym DHFR, das eine wichtige Rolle in der DNA Synthese spielt, zu exprimieren. Zelllinien, bei denen das DHFR-Gen ausgeschaltet wurde, können nur durch Zugabe von Hypoxanthin und Thymidin (HT) in das Zellkulturmedium proliferieren. Durch die Verwendung eines DHFR-Gens als Selektionsgen, das an ein gene of interst (GOI) gekoppelt ist, während einer Zelllinienentwicklung, erlangen die Zellen wieder die Fähigkeit ohne den Zusatz von HT zu überleben. Zusätzlich kann durch Zugabe von MTX zu der Zellkultur erreicht werden, dass sich das DHFR und somit auch das daran gekoppelte GOI amplifiziert. Dadurch kann die Produktivität der entstandenen Produktionszellen gesteigert werden. Es wurde gezeigt, dass unterschiedliche Transfektionsansätze bei der Produktivität stark variieren (3.2.4), was z.B. durch die Kopienzahl und den Integrationsort zustande kommen kann. Daher ist es für die Entwicklung eines Hochproduzentenzellklons zu empfehlen möglichst viele Transfektionsansätze durchzuführen und eine große Menge an Klonen zu screenen.

The market for monoclonal antibodies (mAb) has grown massively in the past decades [1]. To serve the resultant increased demand of mAbs, it is necessary to provide production platforms which fulfill both the high quality and quantity objectives of active pharmaceutical ingredient (API) production [2]. This dissertation describes how a production platform was generated with help of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) method, with which it is possible to produce therapeutic proteins in a high quality and sufficient quantity. The productivity of production cell lines applying this production platform can be increased by adding methotrexate (MTX), a reversible inhibitor of the enzyme dihydrofolate reductase, to the cultivation media. The productivity of the cell clones achieved by this method lies in a three-digit milligram range. The cell line of the production platform was genetically modified by the CIRSPR/Cas9 method. The dihydrofolate reductase (DHFR) gene was knocked out to prevent cell proliferation without supplementation of the cell culture media with hypoxanthine and thymidine. Because of the usage of a DHFR gene as selection gene, which is linked to a gene of interest (GOI), during the cell line development, the cells regain the ability to grow without the supplement. Furthermore the productivity of these cells can be increased by adding MTX to the cell culture media, which causes a amplification of the DHFR gene and the linked GOI. The cell line development experiments showed that the productivity of different transfections lead to various productivities, which can be caused by different copy numbers and integration locations. It is therefore important to perform a large number of transfections to get a adequately high producing cell line. This also applies to the number of cell clones which are screened.

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Schröder, Simon: Entwicklung einer API-Produktionsplattform mittels CRISPR/Cas9 auf Basis einer CHO Zelllinie. 2019.

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