Assoziation von Metabolismus und Virulenz im pathogenen Darmbakterium Clostridioides difficile

Hofmann, Julia Danielle

Der humanpathogene Krankenhauskeim C. difficile hat sich in den letzten Jahren zu einem der häufigsten Erreger nosokomialer und Antibiotika-assoziierter Darmerkrankungen entwickelt. Die Symptome variieren von leichtem Durchfall bis zu pseudomembranöser Kolitis. Nach heutigen Kenntnissen beruht die Infektion auf den Hauptvirulenzfaktoren Toxin A und B. In dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Toxinproduktion und dem Metabolismus untersucht, um aufzudecken, welche Adaptionsstrategien auf ein verändertes Nährstoffangebot die Toxinproduktion beeinflussen. Die Supplementierung mit Cystein und L-Lactat zeigte im Stamm 630 delta erm eine reduzierte extrazelluläre Toxinkonzentration. Die Umsetzung von Cystein führte durch die Bildung von H2S zu einem Eisenmangel. Da Eisen in Form von Ferredoxin nicht für die Übertragung von Elektronen zur Verfügung stand, wurden viele Stoffwechselwege stark reduziert. Im Zentralstoffwechsel wurde die Reaktion der Milchsäuregärung erhöht und es wurden große Mengen L-Lactat sekretiert. Im Gegensatz dazu kam es bei einer Supplementierung mit L-Lactat zu einer Aufnahme des Lactats. Das Lactat wurde über eine über Elektronen-Bifurkation laufende Lactatdehydrogenase zu Pyruvat umgesetzt, wodurch das NAD+/NADH-Verhältnis reduziert wurde. Da die Toxine intrazellulär ähnliche Konzentrationen zeigten, könnte die Reduktion der extrazellulären Toxinkonzentration durch eine aus dem veränderten Redoxpotential resultierenden Konformationsänderung des Holins TcdE zustande kommen. Während eine hohe Glucosekonzentration aufgrund einer Kohlenstoff-Katabolitrepression im Stoffwechsel zu reduzierten extrazellulären Toxinkonzentrationen führte, zeigte eine moderate Glucosekonzentration erhöhte Toxinkonzentrationen. Dies beruhte auf einer höheren Umsetzung von Aminosäuren und einem reduzierten NAD+/NADH-Verhältnis. Die Zugabe von Mannose führte zu erhöhten extrazellulären Toxinkonzentrationen. Kultivierungen mit Mannose zeigten keine, für Kultivierungen mit Glucose nachgewiesene, Zellaggregation in der stationären Phase. Auf diese kann der Unterschied im sekretierten Toxin zurückgeführt werden. Die Abhängigkeit der Toxine von der Zellaggregation und von der Lactatkonzentration konnte auf weitere C. difficile-Isolate übertragen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Verständnis der Zusammenhänge zwischen Stoffwechsel und Toxinproduktion in C. difficile und bieten daher Ansätze für die Erforschung neuer therapeutischer Strategien.

In the last few years the human pathogen C. difficile has developed to one of the most common causes of nosocomial and antibiotic-associated intestinal infections with symptoms vary from mild diarrhoea to pseudomembranous colitis. The major virulence factors are the toxins A and B. Here, the relationship between toxin production and metabolism was investigated in order to uncover which adaptation strategies to an altered nutrient supply influence toxin production. Supplementation with cysteine and L-lactate led to a reduced toxin secretion of strain 630 delta erm. By cysteine supplementation, the toxin production was reduced by a severe iron limitation due to formed hydrogen sulphide during cysteine degradation, resulting in insoluble iron sulphide. This led to a reduced activity of many metabolic pathways in which iron is used as ferredoxin for the transfer of electrons. The carbon flow was re-directed into lactic acid fermentation and high amounts of L-lactate were secreted. In contrast, external supplementation with L-lactate led to an uptake of lactate. By electron bifurcation, the lactate is converted to pyruvate, which reduced the NAD+/NADH ratio. Due to similar intracellular toxin concentrations, conformational changes in the holin TcdE caused by the altered redox potential were suggested as the reason for the reduced extracellular toxin concentration. High glucose concentrations resulted in reduced extracellular toxin concentrations due to carbon catabolite repression in the metabolism. A moderate glucose concentration increased toxin production compared to glucose-free cultures. This was probably due to a higher conversion of amino acids and a reduced NAD+/NADH ratio. The addition of mannose led to strongly increased extracellular toxin concentrations compared to cultivation with glucose. This can be attributed to metabolic differences between planktonic cells and biofilms as the cells grown with mannose did not show cell aggregation in the stationary phase as was demonstrated for cells grown with glucose. The dependence of toxin production on cell aggregation and lactate concentration could also be transferred to other isolates of C. difficile. The results of this work extend the understanding of the relationships between metabolism and toxin production in C. difficile and therefore offer approaches for the investigation of new therapeutic strategies.

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Hofmann, Julia: Assoziation von Metabolismus und Virulenz im pathogenen Darmbakterium Clostridioides difficile. 2019.

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