Characterisation of the KSHV protein ORF20 and its role in innate immunity

Diekmann, Ulrike

As part of the innate immune system, the important cellular pattern recognition receptor (PRR) RIG-I senses the presence of incoming viral particles by binding viral RNA, leading to the transcription of type I interferons (IFN). These cytokines are then secreted and bind to the type I IFN receptor (IFNAR), which induces expression of hundreds of interferon-stimulated gene products (ISGs) that generate an antiviral environment. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a human oncovirus. To establish lifelong infection, KSHV has evolved sophisticated mechanisms to modulate the innate immune response of its host. We identified the poorly characterised KSHV ORF20 protein as a potent inhibitor of the RIG-I-mediated type I IFN response using a luciferase-based reporter screen with 85 open reading frames (ORFs). To better understand the role of ORF20, we used the unbiased approach of quantitative affinity purification coupled to mass spectrometry (q-AP-MS) to identify the cellular interaction partners of ORF20. We found that ORF20 interacted with a variety of ribosomal and nucleolar proteins. Immunofluorescence analysis showed their colocalisation in the nucleolus. Interestingly, distinct localisation patterns of ORF20 correlated with the dispersal of nucleolar and ribosomal proteins from the nucleolus. Furthermore, the antiviral ISG oligoadenylate synthetase-like protein (OASL) was identified as an interaction partner of ORF20 by q-AP-MS. We found that ORF20 specifically interacted with the OAS domain of OASL and that ORF20 and OASL colocalised in the nucleolus. OASL was shown to amplify the type I IFN activation by directly interacting with RIG-I. However, we found that ORF20 did not interfere with colocalisation or interaction of OASL and RIG-I. Surprisingly, we found that the inhibitory effect of ORF20 on RIG-I signalling was independent of OASL expression. By analysing the cellular interaction partners of OASL by q-AP-MS, we found that ORF20 and OASL shared a highly similar interactome. Like ORF20, OASL interacted and colocalised with numerous ribosomal and nucleolar proteins. As the nucleolus is the site of ribosome biogenesis and ORF20 and OASL interact with a number of ribosomal proteins, our data suggest that the cellular protein OASL may have a role for ribosome function, which might be manipulated by the KSHV protein ORF20 to promote KSHV infection.

Als Teil des angeborenen Immunsystems erkennt der zelluläre Pattern Recognition Receptor (PRR) RIG-I virale Infektionen durch die Bindung viraler RNA. Dies führt zur Transkription von Typ-I-Interferonen (IFN) und ihrer Sekretion. Sie binden an den Typ I IFN-Rezeptor (IFNAR) und induzieren die Expression hunderter Interferon-stimulierter Gene (ISGs), was eine antivirale Umgebung erzeugt. Das Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus (KSHV) ist ein humanes Onkovirus. Um eine lebenslange Infektion zu etablieren, hat die KSHV ausgefeilte Mechanismen entwickelt, welche die angeborene Immunantwort ihres Wirtes modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde das KSHV ORF20 Protein als starker Inhibitor der RIG-I vermittelten Typ-I-IFN Antwort identifiziert. Hierfür wurden 85 KSHV open reading frames (ORFs) in einem Luziferase-basierten Reporter Screen untersucht. Um die Funktion von ORF20 zu verstehen, wurde ORF20 mittels quantitativer Affinitätsreinigung gefolgt von Massenspektrometrie (q-AP-MS) und Immunfluoreszenz (IF)-Studien untersucht und die Interaktion von ORF20 mit diversen ribosomalen und nucleolaren Proteinen im Nucleolus identifiziert. Dabei korrelierten bestimmte Lokalisationsmuster von ORF20 mit der Dispersion der im Nucleolus lokalisierten Proteine. Des Weiteren wurde die Interaktion von ORF20 mit dem antiviralen ISG Protein oligoadenylate synthetase-like protein (OASL) durch q-AP-MS ermittelt. Interaktionsstudien zeigten eine spezifische Binding von ORF20 mit der OAS-Domaine von OASL und eine Co-lokalisierung im Nucleolus. Andere Studien zeigten, dass OASL die Aktivierung von Typ-I-IFNs durch direkte Interaktion mit RIG-I verstärkt. ORF20 inhibiert jedoch nicht die Co-lokalisierung oder Interaktion von OASL und RIG-I. Der inhibitorische Effekt von ORF20 auf den RIG-I Signalweg war unabhängig von der OASL-Expression. Eine Untersuchung von OASL mittels q-AP-MS und IF zeigte, dass ORF20 und OASL ein sehr ähnliches Interaktom aufweisen, da OASL mit zahlreichen ribosomalen und nucleolaren Proteinen interagierte. Da der Nucleolus der Ort der Ribosomen-Biogenese ist und ORF20 und OASL mit einer Vielzahl von ribosomalen Proteinen interagierten, deuten die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass das zelluläre Protein OASL eine Rolle in der ribosomalen Funktion spielt, die durch das KSHV Protein ORF20 manipulierten werden könnte, um die Infektion von KSHV zu fördern.

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Diekmann, Ulrike: Characterisation of the KSHV protein ORF20 and its role in innate immunity. 2019.

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