Interaktion von Streptococcus pneumoniae mit Faktoren der Blutgerinnung

Jagau, Hilger

Streptococcus pneumoniae besiedelt den oberen Respirationstrakt des Menschen als opportunistisches Pathogen. Die auch als Pneumokokken bezeichneten Bakterien lösen vor allem bei Kindern, älteren Menschen und immunsupprimierten Personen bis zu 50% aller ambulant erworbenen Lungenentzündungen aus. Im Infektionsverlauf migriert der Erreger durch das alveoläre Lungenepithel und kann sich systemisch im Gefäßsystem ausbreiten. Die Folge sind Septikämien und Meningitiden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, das klinische Pneumokokken Isolate das humane Glykoprotein „von Willebrand Faktor“ (VWF) binden. Hierbei handelt es sich um ein mechanoresponsives Protein der Hämostase. Durch Oberflächenplasmonresonanz-(SPR) und Microscale Thermophorese-Studien konnte die oberflächenassoziierte Enolase der Pneumokokken als bakterielles VWF-Bindungsprotein identifiziert werden und eine Dissoziationskonstante im nanomolaren Bereich ermittelt werden. Die Ergebnisse eines Peptid-Spot Arrays der Enolase gaben erste Hinweise auf ein mögliches VWF-Bindungsmotif, dass eine strukturelle Bindungsfurche in der oktameren Molekülstruktur der Enolase bildet. In Zellkultur-basierten Infektionsstudien konnte der VWF als Adhäsionskofaktor charakterisiert werden, welcher die bakterielle Anheftung an Endothelzellen in Heparin-sensitiver Weise vermittelt. In SPR-Studien konnte zudem eine starke Interaktion zwischen der immobilisierten Enolase und der heterolog exprimierten A1-Domäne des VWF bestätigt und näher charakterisiert werden. Um die VWF-Interaktion unter Scherstress-Bedingungen im Blutgefäßsystem simulieren zu können wurde ein Mikrofluidik System (ibidi®) etabliert. Die mikroskopische Visualisierung lies rot-fluoreszierende Pneumokokken erkennen, die an den VWF-Fäden im konstanten Scherstress von 10 dyn/cm² über einen Zeitraum von bis zu 25 min stabil adhärierten. Darüber hinaus rekrutierten Pneumokokken nach Injektion in 5-Tage alte Zebrafisch-Larven das endogene VWF auf ihrer Oberfläche und adhärierten in vivo an das Gefäßendothel. Nach VWF Präinkubation konnte die Bildung von Bakterien-Aggregaten im Gefäßsystem der Zebrafischlarven nachgewiesen werden. Diese Aggregate sind von hoher pathophysiologischer Relevanz, da sie zu thrombotischen Gefäßverschlüssen führen können. Insgesamt beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine neue, medizinisch hochrelevante Erreger-Wirt-Interaktion.

Streptococcus pneumoniae can colonize the upper respiratory tract as a human opportunistic pathogen. Causing mild infections like otitis media or sinusitis, as well as community acquired pneumonia (CAP) Pneumococci are the infective agent in 50% of all pneumonia in children, elderly people and immune suppressed patients. During the infection, Pneumococci transmigrate through the alveolar epithelium and spread into the vascular system thereby causing septicaemia and meningitides. Results on this PhD thesis confirm the binding of the human glycoprotein “Von Willebrand factor” (VWF) to clinical Pneumococcus isolates. VWF is known as mechanoresponsive protein of the haemostasis. Surface-plasmon-resonanz- (SPR) and microscale thermophoresis-approaches identified the surface localized Enolase of S. pneumonia as VWF-binding protein and determined a dissociation constant within the nanomolar range. Peptide-spot-array results elucidated a putative VWF- binding motif, forming a structural binding-pocket at adjacent sides of two monomers of the octameric pneumococcal Enolase. In addition to the biochemical characterization, functional studies were performed to analyse pathophysiological consequences of the VWF binding of S. pneumoniae. Results of cell-culture infection analyses identified VWF as adhesion cofactor mediating pneumococcus adhesion to the endothelial cell surface in heparin-sensitive manner. SPR-analyses demonstrated a strong interaction between the immobilized Enolase and the heterologous expressed A1-domain of VWF. A microfluidic system (ibidi) was established to analyse the VWF-interaction in shear stress-condition comparable to the bloodstream. This system enabled the generation of multimerised VWF-strings on histamine-stimulated endothelia cells. Microscopic analyses visualized a stable, 25 min. lasting attachment of red fluorescent Pneumococci to VWF strings at a shear force of 10 dyne/cm². Moreover, the recruitment of zebrafish-derived VWF on the surface of pneumococci and bacterial adherence to the vascular endothelium was detected in in vivo-infection analyses of 5-day old zebrafisch larvae. After VWF preincubation, the formation of large bacterial aggregates within the vascular system of the larvae could be visualized. These aggregates are of high pathophysiological relevance, since they can cause thrombus-like vascular occlusion. In conclusion, the results of this thesis describe a new pathogen-host interaction of highest medical relevance.

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Jagau, Hilger: Interaktion von Streptococcus pneumoniae mit Faktoren der Blutgerinnung. 2019.

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