Closing the gap: Measuring Identical Distances by Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule FRET

Molle, Julia

In der Fluoreszenzmikroskopie können Abstandsmessungen und strukturelle Untersuchungen im Bereich zwischen 1 nm und 10 nm mittels strahlungsloser Energieübertragung zwischen einem Donor- und einem Akzeptormolekül durchgeführt werden. Diese Methode (Förster Resonanz Energie Transfer, kurz FRET) ermöglicht die Betrachtung dynamischer Vorgänge und struktureller Eigenschaften von biomolekularen Komplexen. Die Bestimmung von absoluten Abständen wird durch diverse Einflussfaktoren auf die FRET-Effizienz begrenzt. Die Superauflösungsmikroskopie erlaubt aber die Vermessung der absoluten Distanz zwischen zwei Punktlichtquellen. Durch die fortschreitende Weiterentwicklung der DNA-PAINTMethode, die auf dem transienten Binden von Fluoreszenzfarbstoffen sowie deren präziser Lokalisation beruht, ist die exakte Darstellung von Abständen im Bereich von 1 nm - 10 nm möglich und kann erstmals in Korrelation mit FRET-Ergebnissen gebracht werden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgt der Vergleich beider Messmethoden am gleichen biologischen Objekt, um abstandsbestimmende Experimente durchzuführen. Als Referenz dienen selbstassemblierende DNA-Origami Nanostrukturen, auf denen Fluoreszenzsfarbstoffe präzise positioniert werden. Drei Abstände wurden jeweils mit DNA-PAINT und FRET vermessen. Zur Etablierung beider Methoden an einem für die Superauflösungsmikroskopie ausgelegten Messaufbau erfolgten die Untersuchungen auf jeweils entsprechend konzipierten DNA-Origami Nanostrukturen. Die qualitative Durchführung von FRET und DNA-PAINT am gleichen Messaufbau ist in dieser Arbeit gezeigt und kann für zukünftige Anwendungen optimiert werden. Eine quantitative Analyse der FRET-Ergebnisse wurde an einem etablierten konfokalen Mikroskop realisiert, wodurch die Rückführbarkeit auf die Superauflösung bestätigt werden konnte. Durch das erreichte Auflösungsvermögen der DNA-PAINT Methode (<10 nm) wird ihre Anwendbarkeit zur strukturellen Analyse eines einzelnen Proteins in dieser Arbeit überprüft. DNA-Origami Nanostrukturen wurden eingesetzt, um das Protein gerichtet und planar auf diesen zu immobilisieren. So können definierte Bereiche gezielt durch die Superauflösungsmikroskopie abgebildet werden. Das hier untersuchte archaeelle HFQ-ähnliche Protein, das wichtige Aufgaben bei der Genregulation übernimmt, ist mit den Nanostrukturen verbunden und mittels DNA-PAINT vermessen worden. Dabei konnte dessen native Struktur sowie Abstände zwischen definierten Bereichen wiedergegeben werden.

Distance measurements in the biomolecular range are often carried out using Förster Resonance Energy Transfer (FRET). This method allows the observation of dynamics and structural characteristics of biomolecular complexes within 1 nm to 10 nm. However, the determination of absolut distances is limited by certain factors influencing the FRET efficiency. Super-resolution microscopy on the other hand has the capability to precisely determine the absolute distance between two point-like light sources. Due to the rapid developement of the super-resolution microscopy technique DNA-PAINT, based on stochastic binding and unbinding of fluorescent dyes to a target and its continuous localization with high accuracy, distances within 1 nm to 10 nm can be resolved and therefore be correlated with FRET results. Both techniques were combined within the scope of this work in a way that comparative experiments for distance determination are carried out. Self-assembled DNA origami nanostructures carrying fluorophores precisely positioned serve as reference samples. To establish both methods on a setup originally designed for super-resolution microscopy three distances in the nanometer range were created on different DNA origami nanstructures suitable for DNA-PAINT and FRET measurements, respectively. In principle it is possible to perform qualitative FRET meausrements and superresolution fluorescence microscopy on the same setup which offers the possibility in the future to optimize the examinations. A quantitative analysis of FRET values has been carried out by using an established confocal microscope. The retraceability and trustworthyness between both methods to that extend has been validated. Due to the advanced resolution of under 10 nm by DNA-PAINT, its implementation on the structural analysis of a single protein should be investigated in this work, too. DNA origami nanostructures serve as breadboard to immobilze a protein in a planar way. That leads to depicting defined regions of the biomolecule structure by super resolution microscopy. That way, a HFQ-like protein, which has an important role in gene regulatory processes was immobilised via single stranded DNA on the nanostructures and measured by DNA-PAINT. The native structure of the protein as well as distances at distinctive positions were reproduced.

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Molle, Julia: Closing the gap: Measuring Identical Distances by Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule FRET. 2019.

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