Structural analysis of virulence factors and essential proteins of Clostridium difficile

Schwemmlein, Nina

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, endospore-forming bacterium that produces several virulence factors, most prominently the secreted protein toxins Toxin A (TcdA) and Toxin B (TcdB). Clostridium difficile infections (CDI) are often hospital acquired and antibiotic-associated. Treatment of CDI currently involves taking broad-spectrum antibiotics, e.g. vancomycin. Due to the extremely high relapse rate of CDI after antibiotic treatment, the emergence of new highly virulent C. difficile strains and the threatening antibiotic resistance, the need for new therapeutic treatment methods for CDI is more urgent than ever before. To develop new therapeutics, a detailed knowledge of the molecular processes inside the pathogen as well as a comprehensive structural and functional knowledge of its virulence factors and proteins involved in infection is essential. Aim of this thesis was therefore the structural characterization of several important proteins of Clostridium difficile: its main virulence factor TcdB, proteins that are involved in basic cellular processes (i.e. growth and sporulation: CD1219 and CD1823) and the so-called diffocin proteins CD1363 and CD1364, bacteriophage tail-like proteins that act as bacteriocins. Full-length genes of the respective proteins (and truncated fragments of TcdB) were cloned in expression vectors, the proteins were expressed in E. coli or Bacillus megaterium and purified by affinity chromatography, ion exchange chromatography and size exclusion chromatography. Pure protein samples were used for structural analysis by small angle X-ray scattering and X-ray crystallography. SAXS envelopes were calculated for all proteins in this thesis, crystal structures were determined for CD1219, CD1823, CD1363 and CD1364. Based on the crystal structures of the proteins hypotheses about their molecular function could be derived.

Das grampositive, anaerobe, endosporenbildende Bakterium Clostridium difficile produziert mehrere Virulenzfaktoren, allen voran die beiden sekretierten homologen Proteintoxine Toxin A (TcdA) und Toxin B (TcdB). Die von Clostridium difficile verursachten Infektionen werden häufig im Krankenhaus und nach Antibiotika-Behandlung erworben. Die Behandlung erfolgt häufig mit der Einnahme von Breitband-Antibiotika, z.B. Vancomycin. Aufgrund der hohen Rate an Reinfektionen nach Absetzung der Antibiotika-Therapie, der Entdeckung neuer höchst virulenter C. difficile Stämme und deren Antibiotikaresistenz ist der Bedarf an neuen Therapiemöglichkeiten für C. difficile Infektionen dringender denn je. Dafür ist eine detaillierte Kenntnis der molekularen Prozesse im Bakterium, sowie eine umfassende strukturelle und funktionelle Analyse seiner Virulenzfaktoren und anderer Proteine, die an essentiellen Stoffwechselvorgängen und der Infektion beteiligt sind, unerlässlich. Ziel dieser Arbeit war daher die Strukturanalyse verschiedener Proteine aus Clostridium difficile: eines seiner wichtigsten Virulenzfaktoren (TcdB), verschiedener Proteine, die essentiell für das Wachstum bzw. die Sporulation des Bakteriums sind (CD1219 und CD1823) und der Diffocin-Proteine CD1363 und CD1364, die strukturelle Ähnlichkeit zu Bacteriophagen-Schwänzen zeigen und als Bacteriocine agieren. Die Gene der Volllängen-Proteine (sowie Fragmente von TcdB) wurden in Expressionsvektoren kloniert, in E. coli oder Bacillus megaterium exprimiert und über Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration gereinigt. Proteine in ausreichender Reinheit wurden für SAXS (Kleinwinkelröntgenstreuung) und Röntgenkristallographie-Experimente verwendet. In dieser Arbeit konnten SAXS-Hüllen für alle Proteine ermittelt und zusätzlich Röntgenkristallstrukturen für CD1219, CD1823, CD1363 und CD1364 bestimmt werden. Basierend auf den Kristallstrukturen der jeweiligen Proteine konnten Hypothesen über deren molekulare Funktion abgeleitet werden.

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Schwemmlein, Nina: Structural analysis of virulence factors and essential proteins of Clostridium difficile. 2019.

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