Differential contributions of RhoA, -B and -C to cellular processes and host pathogen interactions

Halfen, Jessica

Mammalian Rho GTPases play a key role in regulating the actin cytoskeleton during processes such as cellular trafficking or cell division. RhoA, Rac1 and Cdc42 have been studied extensively in the past. The closely related RhoB and RhoC proteins share 85% sequence identity with RhoA. Nevertheless, RhoB and RhoC have mostly been neglected in the past, since many studies failed to distinguish between Rho subfamily members. Moreover, various pathogens activate or inactivate Rho family GTPases during infection processes to manipulate the actin cytoskeleton. RhoA was studied in this context, but little is known of RhoB and RhoC. For a distinct analysis of RhoA, RhoB and RhoC functions in cellular and infection processes, genetic knockouts of all three proteins were generated, as single deletions and in double combinations, in the murine fibroblast cell line NIH-3T3. Elimination of RhoA, alone or in combination with RhoB or RhoC, slowed down cellular growth and increased the number of multinucleated cells. Deletion of one or two proteins led to an upregulation of the remaining Rho proteins, which was most prominent for RhoB in the absence of RhoA and/or RhoC. Changes of F-actin content were subtle in most cases, while stress fiber formation in RhoAB double KO cells was strongly reduced. In the presence of RhoA and RhoC and the absence of RhoB, namely in RhoB KO cells, Rho kinase expression as well as myosin light chain phosphorylation were increased the most, which is in line with increased F-actin intensities in the same cell type. Moreover, the actin depolymerizing factor Cofilin was found to be upregulated in the absence of Rho. Knockdown of all three Cofilin proteins led to massive induction of stress fibers. Salmonella Typhimurium required RhoA together with RhoC for efficient invasion at early time points. Interestingly, RhoB was strongly upregulated during later stages of infection, which was dependent on the S. Typhimurium effector SopB. The invasion capacity of Shigella flexneri was found to decrease to 20% in the absence of RhoA. In conclusion, the data from this study reveal antagonistic roles for RhoA and RhoB. Furthermore, RhoC appears to promote RhoA activity. Taken together, the Rho single and double KO cell lines generated during this study allow for the first time precise dissection of respective Rho subfamily functions and their differential contributions to fundamental cell biological processes as well as to bacterial or viral infections.

Rho GTPasen spielen in Säugerzellen eine Schlüsselrolle in der Regulation des Aktin Zytoskeletts. RhoA, Rac1 und Cdc42 wurden in der Vergangenheit intensiv analysiert. Die Proteine RhoB und RhoC weisen eine 85%ige Sequenzidentität zu RhoA auf. In vielen Studien wurde jedoch nicht zwischen den drei Proteinen unterschieden. Außerdem aktivieren oder inaktivieren viele Pathogene Rho GTPasen während der Infektion um das Aktin Zytoskelett zu manipulieren. Eine Rolle für RhoA wurde in diesem Kontext bereits nachgewiesen, aber auch hier wurden RhoB und RhoC meist vernachlässigt. Für eine differenzierte Analyse von RhoA, RhoB und RhoC wurden genetische Knockouts von allen drei Proteinen, einzeln und in Doppel-Kombinationen, in der murinen Fibroblasten-Zelllinie NIH-3T3 induziert. Deletion von RhoA, alleine oder zusätzlich zu RhoB oder RhoC, verlangsamte zelluläres Wachstum und erhöhte die Anzahl an Zellkernen pro Zelle. Die Deletion eines Rho Proteins führte zur erhöhten Expression der verbleibenden Rho Proteine, was besonders für RhoB in der Abwesenheit von RhoA und/oder RhoC der Fall war. Die Menge an F-Aktin war in den meisten Fällen kaum verändert, außer bei RhoAB Doppel KOs, in denen Stressfaserbildung deutlich reduziert war. In RhoB KO Zellen, in denen die Expression von RhoA erhöht und RhoC auch exprimiert war, wurden erhöhte Mengen von Rho Kinase Expression und Myosin Phosphorylierung nachgewiesen, was mit erhöhter F-Aktin Menge einherging. Weitere Analysen zeigten eine erhöhte Expression von Proteinen der Cofilin Familie in der Abwesenheit von Rho, welche für die Depolymerisation von Aktin zuständig sind. Infektionsversuche zeigten eine Rolle für RhoA und RhoC während der frühen Invasion von Salmonella Typhimurium. RhoB wurde dagegen in späten Phasen der Infektion hochreguliert, was vom bakteriellen Protein SopB abhängig war. Bei Shigella flexneri sank die Invasionsrate in der Abwesenheit von RhoA noch weiter als für S. Typhimurium, auf 20%. Zusammenfassend zeigen die Daten dieser Arbeit, dass RhoA und RhoB antagonistische Funktionen aufweisen. Außerdem scheint RhoC die Aktivität von RhoA zu begünstigen. In der Gesamtheit lässt sich sagen, dass die Rho KO Zellen, die in dieser Studie generiert wurden, erstmalig eine spezifische Analyse der Funktionen der einzelnen Rho Proteine ermöglichen. Auf diesem Wege können ihre charakteristischen Funktionen für zelluläre Prozesse und bakterielle und virale Infektionen detailliert analysiert werden.

Zitieren

Zitierform:

Halfen, Jessica: Differential contributions of RhoA, -B and -C to cellular processes and host pathogen interactions. 2018.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export