Functional characterization of prenyltransferases involved in the biosynthesis of Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinols in the genus Hypericum

Nagia, Mohamed Mamdouh Sayed

Polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols (PPAPs) are biologically active metabolites found in the family Hypericaceae. Their biosynthesis is achieved in two stages, the formation of the acylphloroglucinol skeleton and then the attachment of prenyl moieties catalyzed by aromatic prenyltransferases (aPTs). Plant aPTs are membrane-bound enzymes with two conserved aspartate-rich motifs. The Chinese medicinal plant Hypericum sampsonii is the richest source of caged PPAPs and prenylated xanthones. Metabolic profiling of in vitro H. sampsonii seedlings revealed the presence of acylphloroglucinol cores, their prenylated intermediates and pseudohypericin. Using homology-based cloning and degenerate primers, aPT transcripts were isolated from the plant. After heterologous expression in insect and yeast cells, the aPT activities of their microsomes were tested against different aromatic substrates. Two recombinant enzymes were xanthone-specific. HsPT8PX converted 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone (1367THX) to its 8-prenylated derivative (8PX) and 8PX to the diprenylated anti-inflammatory xanthone patulone. HsPTpat converted not only 8PX but also 1367THX to patulone only, suggesting two possible biogenetic paths for its formation, either successive prenylation of 1367THX by two enzymes or parallel addition of gem-prenyls by HsPTpat only. Kinetic parameters supported the regiospecific sequential prenylation of 1367THX by HsPT8PX to form 8PX, which is then accepted by HsPTpat to form patulone. Both enzymes had chloroplastic subcellular localization, which augmented their contribution to the same biosynthetic pathway. A third enzyme, HsPTAPG, added a geranyl residue to different acylphloroglucinols, producing the corresponding 3-monogeranyl derivatives. Investigation of substrate specificity and kinetic parameters revealed the substrate preference order as 2-methylbutyrophenone, phlorisobutyrophenone and phlorbenzophenone. The enzyme is supposed to catalyze the first geranylation step in the biosynthesis of the cytotoxic PPAPs hypersampsones and/or sampsoniones. These results suggested the possibility of isolating new PPAPs derived from 2-methylbutyrophenone from the cultivated plant for the first time. All identified HsPTs preferred neutral or slightly basic pH and Mg2+ as a co-factor for their activities. HsPTs can be used as biocatalysts or allow future engineering of the whole pathway for de novo production of active PPAPs in microbes.

Polycyclische Polyprenylierte Acylphloroglucine (PPAPs) sind biologisch aktive Metaboliten der Familie Hypericaceae. Ihre Biosynthese erfolgt in zwei Stufen. Erstens kommt es zur Bildung des Acylphloroglucin-Gerüsts und dann katalysieren aromatische Prenyltransferasen (aPTs) die Anbindung von Prenylresten. Die chinesische Heilpflanze Hypericum sampsonii ist die reichhaltigste Quelle von käfigartigen PPAPs und prenylierten Xanthonen. Metabolisches Profiling ihrer in vitro Keimlinge zeigte das Vorhandensein von Acylphloroglucin-Kernen und ihren prenylierten Intermediaten. Unter Verwendung von Homologie-basierter Klonierung und degenerierten Primern wurden aPT-Transkripte aus der Pflanze isoliert. Nach der heterologen Expression in Insekten- und Hefezellen wurden die Mikrosomen gegen verschiedene aromatische Substrate getestet. HsPT8px-tragende Mikrosomen wandelten 1,3,6,7-Tetrahydroxyxanthon (1367THX) in sein 8-prenyliertes Derivat (8PX) und 8PX in das diprenylierte entzündungshemmende Xanthon Patulon um. HsPTpat katalysierte die Umsetzung nicht nur von 8PX, sondern auch von 1367THX nur zu Patulon, was zwei mögliche biogenetische Wege für seine Bildung nahelegt, entweder aufeinanderfolgende Prenylierungen von 1367THX durch zwei Enzyme oder die parallele Addition von gem-Prenylresten durch ausschließlich HsPTpat. Die kinetischen Parameter unterstützen die regiospezifische sequentielle Prenylierung von 1367THX. Beide Enzyme hatten eine chloroplastidäre subzelluläre Lokalisation, was ihren Beitrag zu demselben Biosyntheseweg stützte. Ein drittes Enzym, HsPTAPG, fügte einen Geranylrest an verschiedene Acylphloroglucinole, woraus die entsprechenden 3-Monogeranylderivate resultierten. Die Untersuchung der Substratspezifität und der kinetischen Parameter enthüllte die Reihenfolge der Substratpräferenz als 2-Methylbutyrophenon, Phlorisobutyrophenon und dann Phlorbenzophenon. Das Enzym katalysiert vermutlich den ersten Geranylierungsschritt in der Biosynthese der zytotoxischen PPAPs Hypersampsone und/oder Sampsonione. Diese Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, neue PPAPs, die von 2-Methylbutyrophenon abgeleitet sind, erstmals aus der Kulturpflanze zu isolieren. HsPTs bevorzugten einen neutralen oder leicht basischen pH-Wert und Mg2+ als Kofaktor für ihre Aktivitäten. HsPTs können als Biokatalysatoren dienen und ermöglichen die zukünftige Entwicklung gesamter Pfade für die de novo Produktion aktiver PPAPs in Mikroben.

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Nagia, Mohamed: Functional characterization of prenyltransferases involved in the biosynthesis of Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinols in the genus Hypericum. 2018.

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