Untersuchungen zur Isoform a2b1 der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase hinsichtlich ihrer subzellulären Lokalisation und möglicher Interaktionspartner

Hochheiser, Julia

Die Stickstoffmonoxid-sensitive Guanylyl-Cyclase (NOsGC) ist das Schlüsselenzym des NO/cGMP-Signalwegs. Von den beiden katalytisch aktiven Isoformen a1b1 und a2b1 liegt letztere in HEK293-Zellen vermittelt über das PDZ-Bindemotiv der a2-Untereinheit an Zell-Zell-Kontakten vor. In der vorliegenden Arbeit wurde diese besondere Lokalisation weiter charakterisiert und der direkte Interaktionspartner, der sie vermittelt, als Lin7a identifiziert. Zusätzlich wurde der dreiteilige Komplex aus Lin7a, MPP3 und Nectin-1 untersucht und in seiner Gesamtheit zum ersten Mal beschrieben. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Phosphorylierung der b1-Untereinheit in Position 192 die Zell-Zell-Kontakt-Lokalisation der Isoform a2b1 verstärkt, aber keine Voraussetzung für diese spezifische Lokalisation darstellt. Eine Phosphorylierung innerhalb des PDZ-Bindemotivs, wie sie die Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase II (CAMKII) katalysieren kann, verhindert die Zell-Zell-Kontakt-Lokalisation von a2b1. Es ist ein Modell denkbar, in dem die Phoshorylierung durch die CAMKII die NOsGC weg von Lin7a am Zell-Zell-Kontakt und hin zu einem anderen Bindungspartner lenkt. Lin7a wurde als direkter Interaktionspartner des Heterodimers a2b1 identifiziert. Basierend auf Immunopräzipitationen mit Proben aus murinem neuronalen Gewebe konnte eine besonders starke Interaktion zwischen Lin7a und a2b1 im Synaptosom nachgewiesen werden. Untersuchungen mit fluoreszenzproteinmarkierten Lin7a-Konstrukten deuten auf einen Zusammenhang zwischen dieser Interaktion und der Zell-Zell-Kontakt-Lokalisation der NOsGC-Isoform in HEK293-Zellen. Sowohl Lin7a als auch die NOsGC-Isoform a2b1 sind über calciumunabhängige Zell-Adhäsionsmoleküle am Zell-Zell-Kontakt verankert. Während der genaue Aufbau des Komplexes, der Lin7a und b1a2 an die Membran dirigiert, vermutlich von physiologischer Situation und Zelltyp abhängig ist, wird in der vorliegenden Arbeit ein potenzieller Weg über das Zell-Adhäsionsmolekül Nectin-1 und das MAGUK (Membrane-associated guanylate kinase) MPP3 aufgezeigt. Im letzten Abschnitt der Arbeit wurde der dreiteilige Komplex aus Nectin-1, MPP3 und Lin7a genauer untersucht. Das MAGUK MPP3 bildet mit den Bereichen amino- und carboxyterminal der GK-Domäne eine beta-Faltblatt-Struktur, die für die Interaktion mit Nectin-1 erforderlich ist. Vermutlich interagiert das gesamte PSG-Modul von MPP3, bestehend aus PDZ-, SH3- und GK-Domäne, mit dem cytosolischen Teil von Nectin-1.

NO-sensitive guanylate cyclase (NOsGC) is the key enzyme of the NO/cGMP pathway. There are two catalytically active isoforms: a1b1 and a2b1, which show distinct distributions within the cell. While a1b1 can be found in the cytosol, a2b1 is localized at cell-cell contacts. This special localization is mediated by the PDZ binding motif of the subunit a2. In this study, we identified Lin7a as critical binding partner and mediator of the cell-cell contact localization of NOsGC Isoform a2b1. Furthermore we characterized a previously undescribed three partied complex, consisting of Lin7a, MPP3 and Nectin-1. Our results suggest that phosphorylation of the b1 subunit at position 192 enhances cell-cell contact localization of the NOsGC isoform a2b1. However, phosphorylation in position 192 of the b1 subunit is no prerequisite for this specific localization. The carboxyl-terminal residues of the a2 subunit form not only the PDZ binding motif, but also a potential recognition site for the CaMKII. This potential phosphorylation of the PDZ binding motif prevents the cell-cell contact localization of a2b1. Hence, we propose a model in which phosphorylation by the CAMKII directs NOsGC isoform a2b1 away from cell-cell contacts towards binding partners like Scribble or PSD-95, that direct the protein to different locations. We show that the a2b1 isoform interacts with Lin7a in mouse brain synaptosomes based on co-precipitation analysis. Investigations with fluorescently-labeled Lin7a constructs suggest a connection between the interaction of Lin7a with a2b1 and the cell-cell contact localization of the NOsGC isoform in HEK293 cells. Both Lin7a and the NOsGC isoform a2b1 are directed to cell-cell contacts via calcium-independent cell adhesion molecules. While the exact structure of the complex, which directs Lin7a and a2b1 to the membrane, presumably depends on the physiological situation and cell type, the present work demonstrates the involvement of the cell adhesion molecule Nectin-1 and the Membrane-associated guanylate kinases (MAGUK) MPP3. In the last section of the thesis, the three-partied complex of Nectin-1, MPP3, and Lin7a was examined in more detail. The MAGUK MPP3 forms a b-sheet structure with residues amino- and carboxyl-terminal of the GK domain. This beta-sheet is necessary for the interaction between MPP3 and Nectin-1. Presumably, the entire PSG-module of MPP3, consisting of PDZ-, SH3- and GK-domain, interacts with the cytosolic part of Nectin-1.

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Hochheiser, Julia: Untersuchungen zur Isoform a2b1 der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase hinsichtlich ihrer subzellulären Lokalisation und möglicher Interaktionspartner. 2018.

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