Charakterisierung der Paenibacillus larvae Genotypen ERIC I-V und alternative Therapieverfahren zur Behandlung der Amerikanischen Faulbrut

Beims, Hannes

In dieser Arbeit wurde der Erreger der Amerikanischen Faulbrut (AFB), Paenibacillus larvae charakterisiert. Dieses Bakterium wird in vier Genotypen mit unterschiedlicher Virulenz eingeteilt. Eine Therapie der AFB ist nicht möglich. Für diese Arbeit wurden Honigproben auf die Abundanz von P. larvae untersucht. Hierbei konnte ein fünfter Genotyp isoliert und beschrieben werden. Durch die Genomsequenzierung der fünf Genotypen konnten Differenzierungen im Hinblick auf NRPS/PKS-Gencluster erfolgen. Die hierdurch kodierten Sekundärmetabolite stellen potentielle Virulenzfaktoren dar. Paenilarvin A-C wurden hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität gegenüber Brut und Vertretern des Mikrobioms der Biene getestet. Eine Bestätigung als Virulenzfaktor konnte nicht erfolgen. Weiterführende Arbeiten zeigten, dass Paenilarvine eine biologische Aktivität gegenüber einer Vielzahl an Mikroorganismen aufweisen. Diese Ergebnisse lassen eine Funktion als Fitnessfaktoren bei der Schaffung der ökologischen Nische vermuten. Ergänzend wurden Versuche zur biologischen Aktivität von Thyrotricinen gegenüber Brut und dem Mikrobiom der Biene durchgeführt. Die Schadschwelle der Konzentration für Bienenbrut konnte bestimmt werden. Diese lag deutlich über der minimalen Hemmkonzentrationen gegenüber P. larvae. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Tests auf die therapeutische Eignung gegen die AFB in vivo durchgeführt. Dieser Effekt konnte nicht gezeigt werden. Stattdessen wiesen die Testindividuen eine erhöhte Mortalität auf. Weiterhin wurden P. larvae-spezifische Bakteriophagen (Phagen) hinsichtlich ihrer potentiellen therapeutischen Eignung analysiert. Zehn Phagen-Isolate konnten in dieser Arbeit charakterisiert werden. Ein Therapieerfolg konnte durch die singuläre Applikation des Phagen HB10c2 nicht erzielt werden, jedoch wurden Erkenntnisse für die sichere Anwendung und Voraussetzungen für eine Phagentherapie etabliert. Durch Modifizierungen der Therapieversuche wurde für die kontinuierliche Applikation des Phagen HB? ein Therapieerfolg gezeigt. Durch die Sequenzierung des Phagen HB10c2 konnten Markergene identifiziert werden, die zur Charakterisierung der Phagen-Isolate herangezogen wurden. Diese ergab, dass alle isolierten Phagen über eine Integrase verfügen und somit zu den lysogenen Phagen zählen. Dieses Ergebnis deutet auf eine koevolutionäre Adaption der Bakteriophagen an ihren Wirt und dessen Lebensraum Bienenvolk vor dem Hintergrund der jahreszeitlichen Entwicklungsstadien hin.

This work focusses on Paenibacillus larvae, the causative agent of American Foulbrood (AFB) in honeybees. This bacterium can be subdivided into four genotypes that differ in their virulence. A therapeutic approach does not exist. During this work, honey samples were analyzed for the abundance of P. larvae. Thereby, a new fifth, highly virulent genotype was discovered and described. Sequencing of all five genotypes allowed differentiations between ERIC I-V. Therefore, genomes were analyzed for NRPS/PKS gene clusters. These encoded secondary metabolites are known as potential virulence factors. Paenilarvins were analyzed for their biological activity against bee brood and representative bacterial strains of the bees gut microbiota. Paenilarvins could not be verified as virulence factors. Further studies on this topic indicated an activity of paenilarvins against a number of microorganisms. According to these results, paenilarvins may act as fitness factor to create an ecological niche for P. larvae. Additionally experiments were performed to determine the biological activity of thyrotricins (Trcs) against honeybee brood and microbiota of A. mellifera. The ecologically harmless concentration against bee larvae, which was much higher than the minimal inhibitory concentration against the P. larvae, was determined. Based on these results, Trcs were used for analysis of their therapeutic potential against AFB. Nevertheless, treated individual showed an increase of mortality. As an alternative therapy, P. larvae-directed bacteriophages (phages) were analyzed for their potential therapeutic use. A number of ten phage isolates were characterized. Phage HB10c2 was tested for its application in a primary study. Decreasements of mortality in treated individuals could not be. But the essentials for a safe application of phages in honeybees could be derived from these results. By modifications of phage application with phage HB? a decrease of mortality in treated individuals could be shown. Furthermore, sequencing of phage HB10c2 indicated some marker genes that were used for the characterization of phage isolates during this work. Thereby, all phage were identified to carry an integrase in their genomes, which indicate them as lysogenic phages. Taken together, these results indicate co-evolutionary adaption of the phages and their host P. larvae in their shared environment honeybee, respective to the developmental stages of the colony among the seasons.

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Beims, Hannes: Charakterisierung der Paenibacillus larvae Genotypen ERIC I-V und alternative Therapieverfahren zur Behandlung der Amerikanischen Faulbrut. 2018.

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