Immobilisierung von Enzymen für die multienzymatische Synthese von Laminaribiose

Müller, Clarissa Brigitte

Die Enzyme Sucrosephosphorylase und Laminaribiosephosphorylase wurden kovalent auf Sepabeads EC-EP/S fixiert und zusammen mit immobilisierter Glucoseisomerase erfolgreich zur trienzymatischen Produktion von Laminaribiose eingesetzt. Die Bedingungen für ein trienzymatisches System wurden nach Charakterisierung der immobilisierten Enzyme mithilfe statistischer Versuchsplanung hinsichtlich ihrer Puffermolaritäts- und pH- sowie Temperaturpräferenzen auf 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,3) und 37 °C festgelegt. Da die trienzymatische Produktion von Laminaribiose durch Glucoseisomerase beeinträchtigt wird, wurde die bienzymatische Produktion von Laminaribiose aus Saccharose und Glucose mit Sucrosephosphorylase und Laminaribiosephosphorylase einer trienzymatischen Produktion vorgezogen. Die bienzymatische Produktion konnte im Mikroreaktionsgefäß mit Ausbeuten von 20 % praktisch exemplarisch umgesetzt werden. Zur Erhöhung der Stabilität der immobilisierten Enzyme für eine kontinuierliche Produktion wurden die Sepabeads in Chitosan eingeschlossen. In den sich ergebenden Hybridimmobilisaten kann Laminaribiosephosphorylase auf Sepabeads EC-EP/S mit Feststoffgehalten von 3 % ohne Aktivitätsverluste eingeschlossen werden. Nach Charakterisierung der Laminaribiosephosphorylase wurden die Bedingungen für die bienzymatische Produktion auf 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 6) und 35 °C festgelegt. Unter diesen Bedingungen hat Laminaribiosephosphorylase eine Halbwertszeit von 94,4 ± 21,2 h in Puffer bzw. 202 ± 13 h in Anwesenheit von Saccharose. Die Halbwertszeit des Enzyms und Versuche zur Umsetzbarkeit des bienzymatischen Systems beweisen (Ausbeute 2,6 %), dass die Entwicklung von Enzymimmobilisaten für die kontinuierliche Produktion von Laminaribiose erfolgreich war.

The enzymes sucrose phosphorylase and laminaribiose phosphorylase were covalently fixated on Sepabeads EC-EP/S. They were successfully used together with immobilized glucose isomerase for synthesis of laminaribiose from sucrose. Conditions for a trienzymatic system were fixed to 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.3) and a temperature of 37 °C after characterization of the immobilized enzymes regarding their preferences for buffer molarities, pH and temperature using design of experiments. Since the feasibility of the system is impaired by glucose isomerase bienzymatic production of laminaribiose from sucrose and glucose with sucrose phosphorylase and laminaribiose phosphorylase was chosen over trienzymatic production. Bienzymatic production of laminaribiose was exemplarily implemented in a micro reaction vessel with a yield of 20%. To further improve their stability for continuous production, the enzymes on Sepabeads EC-EP/S were encapsulated in chitosan. The resulting hybrid immobilizates can encapsulate a solid content of 3% Sepabeads EC-EP/S without loss of activity for laminaribiose phosphorylase. After characterization of laminaribiose phosphorylase hybrid immobilizates the conditions for bienzymatic production were fixed to 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6) at 35 °C. Under this conditions Laminaribiose phosphorylase has a half-life of 94.4 ± 21.2 h in buffer and 202 ± 13 h in presence of sucrose at bienzymatic production conditions. The half-life of the enzyme together with proof of concept bienzymatic production (yield 2.6%) showed that the development of enzyme immobilizates suitable for continuous production of laminaribiose was successful.

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Müller, Clarissa: Immobilisierung von Enzymen für die multienzymatische Synthese von Laminaribiose. 2018.

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