Untersuchungen zur subzellulären Dynamik, Funktion und Aktivität von Kinasen des MAK-2 MAP-Kinasen-Moduls während der Zell-Zell-Kommunikation in Neurospora crassa

Illgen, Julia

In dem filamentösen Pilz Neurospora crassa wachsen keimende Sporen gerichtet aufeinander zu und fusionieren, was zur frühen Etablierung der Kolonie beiträgt. Während der Zell-Zell-Kommunikation weisen die MAP-Kinase MAK-2 und SO, ein Protein unbekannter molekularer Funktion, eine ungewöhnliche subzelluläre Dynamik auf. Die beiden Proteine lokalisieren abwechselnd oszillierend an den Spitzen der interagierenden Keimlinge. Auf Basis dieser Beobachtung wurde vorgeschlagen, dass die Zellen schnell zwischen zwei physiologischen Zuständen wechseln, dem Senden (SO lokalisiert an der Spitze) und dem Empfangen eines Signals (MAK-2 lokalisiert an der Spitze). Dieses als „Zelldialog“ bezeichnete Modell bietet eine Erklärung dafür, wie genetisch identische Keimlinge über eine räumliche Distanz miteinander kommunizieren ohne sich selbst zu stimulieren. In dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der subzellulären Lokalisation, der Aktivität und der Funktion von MAK-2 und der aktivierenden MAPKK MEK-2 untersucht. Die Dynamik der Kinasen wurde durch eine künstliche Membranverankerung über einen Farnesylanker vollständig unterbrochen. Obwohl die Membranlokalisation von MAK-2 zu einer Hyperphosphorylierung der Kinase führt, die mit dem Aktivierungsstatus korreliert, ist die Dynamik der Kinase essentiell für ihre Funktion. Diese Beobachtung führt zu der Vermutung, dass die Aktivierung der Kinase an der Plasmamembran erfolgt, während die aktivierte native Kinase in den Zellkern transloziert um ihre Aufgaben zu erfüllen. Im Gegensatz dazu trägt die subzelluläre Dynamik der MAPKK MEK-2 zu der Funktion der Kinase bei, ist aber nicht essentiell. Überraschenderweise führt die Überexpression der membrangebundenen MAPKK MEK-2 zu einem starken Polaritätsdefekt in Keimlingen und zeigt damit eine direkte Verbindung zwischen der intrazellulären Signaltransduktion und der Polaritätsmaschinerie auf, die für die Zellantwort des gerichteten Wachstums notwendig ist. Insgesamt hebt diese Arbeit den engen Zusammenhang zwischen der Lokalisation, Aktivität und Funktion von Proteinen hervor, der zu unserem Verständnis der intrazellulären Signaltransduktion und ihrer Rolle bei der Regulation von spezifischen Zellantworten beiträgt.

In the filamentous fungus Neurospora crassa germinated spores direct their growth towards each other and fuse, thereby promoting the early steps of colony formation. During directed growth, the MAP kinase MAK-2 and SO, a protein of unknown molecular functions, show very unusual subcellular dynamics. Both proteins are recruited to the tips of interacting germlings in an alternating and oscillatory manner. Based on this observation, a model was proposed in which the interacting cells rapidly alternate between two physiological stages, that were associated with the sending (SO accumulates at the cell tip) and receiving (MAK-2 accumulates at the cell tip) of a still unknown signal. The so called “cell dialog” helps to explain how genetically identical cells communicate over a distance, while avoiding self-stimulation. In this study a combination of genetic engineering, live cell fluorescence imaging and western blot analysis was used to examine the relationship between the subcellular localization, activity and function of the map kinase MAK-2 and its activating kinase, the MAPKK MEK-2. By tethering the kinases permanently to the plasma membrane via a farnesyl-anchor the subcelluar dynamics of the kinases were completely disrupted. Membrane restriction greatly impacted the phosphorylation status and function of the kinases. Although the membrane recruitment of MAK-2 led to a hyperphosphorylation, indicating hyperactivation, the dynamic behaviour was shown to be absolutely essential for the function of the kinase, suggesting that activation might occur at the plasma membrane while the native kinase needs to enter the nucleus to fulfill its function. In contrast, the dynamic behaviour of MEK-2 promotes the function of the MAPKK, but is not essential. Surprisingly, overexpression of the membrane tethered MAPKK MEK-2 led to a severe polarity defect in germlings, linking the components of the intracellular signal transduction pathway to the polarity machinery mediating cellular response. Together, these results emphazise the strong relationship between the dynamics, activity and function of signaling proteins and might enhance our understanding of intracellular signal transduction pathways and their role in regulating specific cellular outputs.

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Illgen, Julia: Untersuchungen zur subzellulären Dynamik, Funktion und Aktivität von Kinasen des MAK-2 MAP-Kinasen-Moduls während der Zell-Zell-Kommunikation in Neurospora crassa. 2018.

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