Untersuchungen der Populationsheterogenität während der heterologen Proteinproduktion in Bacillus megaterium

Münch, Karin Michaela

Bei Bacillus megaterium handelt es sich um einen attraktiven Wirt für die heterologe Protein- produktion, dessen Expressionssystem mit Hilfe eines Xylose-induzierbaren Promotors (PxylA) immer mehr zu einer Produktionsmaschinerie für rekombinante Proteine entwickelt wurde. Das System basiert auf einem multicopy Plasmid, dessen Bestandteile aus dem genomischen xylABT-Operon stammen. In Abwesenheit von Xylose wird die Expression des Operons durch den Xylose-Repressor xylR verhindert. In Gegenwart von Xylose bindet diese an den Repressor, was die Repression aufhebt und die Expression des Operons bewirkt. Zur Validierung wurde das mittels Fluoreszenzmessung leicht nachweisbare eGFP, an den PxylA-Promotor fusioniert. Obwohl Vektorsysteme entwickelt wurden, die bis zu 1,25 g/l eGFP produzierten, zeigte ein Teil der Kultur auf Einzelzellebene eine Heterogenität bezüglich der Proteinproduktion. Daten aus qRT-PCR-Analysen von sortierten Zellen deckten die relativen Expressionsverhältnisse der beteiligten Gene auf. Daraufhin wurden drei mögliche Faktoren untersucht. Durch die Induktion des XylR-Repressors könnte zum einen freie Xylose wegtitriert werden, was die Gleichgewichte in der Zelle verschieben würde (1). Zum anderen könnten ungleichmäßige Plasmidverteilungen als Folge der Zellteilung (2) oder Effekte beim Altern von Zellen (3) eine maßgebliche Rollen spielen. Um dies zu überprüfen, wurde XylR mit dem Fluoreszenzprotein mCherry fusioniert und Zeitraffer-Filme einer wachsenden Mikrokolonie aufgenommen. Dabei wurde sowohl die Produktion von eGFP, als auch von mCherry als Reaktion auf Xylose aufgezeichnet. Des Weiteren wurde ein Plasmid konstruiert, dem das xylR-Gen fehlt. Um konkrete molekulare Informationen über den Einfluss der Plasmidkopienzahl zu gewinnen, wurde das Plasmid durch zusätzliche XylR-Bindestellen, die mit mCherry fusioniert wurden, visualisiert. Analysen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurden zur direkten zellulären Lokalisation des Plasmids eingesetzt. Die gewonnen Daten legten nahe, dass selbst bei selektiven Bedingungen die beobachtete bimodale Verteilung kein Resultat von Gen-Regelkreisen war, sondern ein Phänomen der ungleichen Plasmidsegregation zwischen Tochterzellen. Die Beobachtungen wurden in ein mathematisches Modell integriert, um das bistabile Produktionsverhalten über Computersimulationen zu reproduzieren.

Within the last years Bacillus megaterium was systemically developed for the gram per liter production of recombinant proteins using the strong xylose-inducible promoter system PxylA. The expression system is based on a multicopy plasmid containing the functional elements of the system – the gene encoding the repressor XylR and the promoter PxylA. For a deeper understanding, PxylA was fused to the coding sequence of the green fluorescent protein (GFP). In absence of xylose its expression is repressed by the xylose repressor XylR while in the presence of xylose the expression is derepressed. Although high yields of GFP were produced the culture showed a significant level of heterogeneity at the single cell level during the recombinant protein production process with up to 30 % of low-producing cells leading to three speculative working models or combinations of them – (1) an imbalanced repressor inducer equilibrium, (2) an unequal distribution of plasmids during cell division or (3) cell aging effects. In order to validate these models, new plasmids carrying different modifications were generated. For an estimation of the single cell XylR abundance and intracellular distribution the plasmid encoded xylR gene was translationally fused to mCherry. Further, the intracellular ratio of repressor molecules and DNA binding sites was modified by deleting this xylR gene and introducing additional XylR binding sites. Finally, alternative origins of replication were introduced to change and affect the plasmid copy number. All new plasmid strains were analyzed with respect to their overall GFP production behavior grown under different conditions. Single cell analyses were performed using time-lapse microscopy and flow cytometry to get an insight in the production dynamics of distinct cell lineages and subpopulation distributions. In addition, fluorescence in situ hybridization (FISH) experiments were performed to localize the plasmids in the cells. Derived results led to the hypothesis, that heterogeneous production behavior is probably a consequence of unequal plasmid distribution. Finally, the observations were incorporated into an extended mathematical model in order to reproduce the bistable production behavior via computer simulations.

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Münch, Karin: Untersuchungen der Populationsheterogenität während der heterologen Proteinproduktion in Bacillus megaterium. 2018.

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