DNA-Origami-Nanostrukturen als modulare Plattform für die photophysikalische Charakterisierung einzelner fluoreszierender Moleküle und die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie

Jusuk, Ija

Die Entwicklung superauflösender Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, die Beugungsgrenze des Lichtes (ca. 250 nm) zu überwinden. Um die Auflösung von Mikroskopen zu testen sowie Vergleiche zwischen unterschiedlichen superauflösenden Methoden zu gestalten, eigenen sich am besten fluoreszenzmarkierte DNA-Origami-Strukturen, sogenannte Nanometerlineale. Dabei handelt es sich um DNA-basierte, selbstassemblierte Nanostrukturen, welche als molekulare Plattform zum Platzieren von Fluorophoren in einem frei wählbaren nm-Abstand fungieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, wie photophysikalische Eigenschaften der Cyanin-Farbstoffe im Hinblick auf die Superauflösungsmethode dSTORM optimiert werden können. Die Photonenzahl pro Anzustand bzw. Lokalisierung wurde maximiert, indem dSTORM mit unterschiedlichen Triplett-Quenchern wie Cyclooctatetraen sowie einem Redoxsystem kombiniert wurde. In beiden Fällen konnten die Anzustände signifikant verlängert werden, wobei unterschiedliche Wirkungsmechanismen der Triplett-Quencher identifiziert wurden. Die Untersuchungsergebnisse einzelner Farbstoffe konnten anhand der Nanometerlineale direkt auf die Superauflösungsmikroskopie übertragen werden, wobei eine Verdreifachung der Photonenzahl pro Lokalisierung realisiert wurde. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Fluoreszenzmarkierungen für DNA-Origami-Strukturen mit fluoreszierenden Proteinen wie EYFP zu erweitern. Hierzu wurden EYFPs mittels Genexpression in E. coli-Zellen produziert und unter Aufrechterhaltung der Fluoreszenzfähigkeit stöchiometrisch kontrolliert an DNA gekoppelt. Einzelmolekül-Fluoreszenzuntersuchungen unter Benutzung der DNA-Origami-Strukturen ergaben zwar ein Blinkverhalten im ms-Bereich, jedoch blieben die photophysikalischen Eigenschaften wie z.B. Photostabilität optimierungsbedürftig. Unter Benutzung von chemischen Bedingungen von dSTORM (Sauerstoffentzug und Thiole) konnte ein stark stabilisierender Effekt auf EYFP festgestellt werden. Diese Ergebnisse wurden ebenso anhand der Superauflösungsmikroskopie der mit EYFP-markierten Nanometerlineale und Mikrotubuli in Zellen verifiziert. Im letzten Schritt wurden nanometrologische Untersuchungen unternommen, um die Nanometerlineale zu Standards weiterzuentwickeln. In Kooperation mit der PTB wurde ein Kalibrierverfahren für die Rückführung der gemessenen Abstände mit dazu gehöriger Aufstellung eines Messunsicherheitsbudgets entwickelt.

Superresolution fluorescence microscopy is capable of resolving small nanometer-sized objects by overcoming the diffraction limit of light (ca. 250 nm). Fluorescently labeled DNA origami test structures are very useful for testing the resolution of a microscope or for comparing different superresolution methods. These structures are self-assembled, programmable molecular breadboards for placing fluorescent labels in a desired pattern with a precision of about 1 nm. One of the goals of this work was to optimize photophysical properties of cyanine dyes with respect to dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) localization-based superresolution microscopy. The focus was aimed at maximizing the number of photons per ON-state and thus per localization. For these purposes different triplet quenchers (cyclooctatetraene and a redoxsystem) were combined with dSTORM. In both cases, investigated by single-molecule experiments, increased duration of ON-states and therefore increased number of photons were achieved. However, different mechanisms of action were observed for the used triplet quenchers. The results of the photophysical investigations were transferred to the superresolution microscopy using DNA origami test structures, resulting a 3-fold increase of the photon number. A further aim of this work was labeling DNA origami structures with fluorescent proteins (e.g. enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) and investigating possible optimizing effects of external stimuli on the photophysical properties of EYFP. First, for labeling of DNA origami structures EYFP was coupled covalently to a DNA strand. The chemical composition of dSTORM could improve significantly the photostabilty of single EYFP-molecules by a factor of 5. This stabilizing effect of dSTORM was also varified by superresolution imaging of EYFP-labeled DNA origami test structures and mammalian Vero cells. In both cases, due to the increased photostability of EYFP by dSTORM the quality of superresolved images could be significantly improved, revealing more structural information. The last goal of this work was exploring the application of DNA origami test structures in the nanometrology. This was necessary for the further development of fluorescently labeled DNA origami nanorulers from test structures to standards on the nanometer scale. In cooperation with the PTB Braunschweig a calibration procedure for the traceability of the measured nanometer distances was developed.

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Jusuk, Ija: DNA-Origami-Nanostrukturen als modulare Plattform für die photophysikalische Charakterisierung einzelner fluoreszierender Moleküle und die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie. 2018.

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