Fluoreszenz- und streuungsbasierte Einzelmolekülmikroskopie an DNA-Origami-Nanostrukturen

Wünsch, Bettina

Seit der Einführung der DNA-Origami-Technik im Jahr 2006 durch P. Rothemund können dreidimensionale Nanostrukturen durch eine einfache Bottom-up-Synthese hergestellt werden. Diese ermöglichen eine exakte Positionierung von Bio- und Farbstoffmolekülen im einstelligen Nanometerbereich. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von T. Liedl (LMU München) wurde eine molekulare Kraftklammer entwickelt, bei der über Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energie-Transfer (smFRET) die zwischen Biomolekülen wirkenden Kräfte ausgelesen werden. Die Untersuchung der Holliday Junction und des TATA-Box-bindenden Proteins auf ihr Verhalten unter kontrollierter Krafteinwirkung hin zeigte, dass die molekulare Kraftklammer aufgrund ihrer Robustheit ein geeignetes System ist, Kräfte im niedrigen Pikonewton Bereich zu messen und jegliche Systeme zu untersuchen, die mit DNA wechselwirken oder selbst durch DNA modifizierbar sind. Dass FRET nicht nur ein Werkzeug, sondern auch ein in der Natur auftretender Effekt ist, zeigt sich in Lichtsammelkomplexen (LSK). Dort sammeln mehrere Donormoleküle Sonnenlicht ein und übertragen die Energie via FRET auf einen Akzeptor. Um die Effizienz eines solchen Systems zu bestimmen, wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von U. Keyser (University of Cambridge) synthetische LSKs basierend auf der DNA-Origami-Technik entwickelt und mittels smFRET-Messungen auf ihren Antenneneffekt hin untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich DNA-Nanostrukturen aufgrund ihrer Homogenität und Robustheit als Gerüst für die Entwicklung von LSKs eignen. Die notwendigen hohen Laserleistungen (bis zu 1 kW/cm²) bei der Einzelmolekülmikroskopie schränken die möglichen Anwendungen jedoch stark ein. Daher wurden neuartige Nanoantennen auf DNA-Basis entwickelt, die durch die räumliche Nähe von metallischen Nanopartikeln zu Farbstoffmolekülen eine Verstärkung der Anregungs- und Emissionsrate erreichen und so Messungen bei deutlich niedrigeren Laserleistungen ermöglichen. Um diese für die molekulare Diagnostik weiterentwickeln zu können, müssen die auftretenden Effekte verstanden werden. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Entwicklung einer Methode um die optischen Eigenschaften des metallischen Nanopartikels mit denen des Farbstoffmoleküls auf Einzelmolekülebene zu korrelieren und so das Verständnis über plasmonische Effekte in Nanoantennen zu erweitern.

Since the DNA origami technique was introduced in 2006 by P. Rothemund, three dimensional nanostructures can be assembled via bottom-up synthesis. These enable the exact positioning of biomolecules and dyes in the range of a few nanometres. Together with the working group of T. Liedl from the LMU München, we developed a molecular force clamp which is used for the readout of forces that exist between biomolecules via single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET). By studying the properties of the Holliday Junction and the TATA-binding protein with respect to the amount of applied force, it was demonstrated that, due to its robustness, the molecular force clamp is a system which is suitable for the measurement of forces of a few piconewton of every system that interacts with DNA or can be modified with DNA. However, FRET is not only a tool to study distance dependent interactions but it is also present in natural light harvesting complexes (LHC). These consist of multiple donor molecules that collect sun light and transfer the energy to an acceptor via FRET. To determine the efficiency of such a system, the antenna effect of synthetic LHCs based on the DNA origami technique were studied together with the working group of U. Keyser from the University of Cambridge. With single-molecule FRET measurements, it was possible to show that the synthesized samples are very homogenous and further that the DNA nanostructures are suitable as a platform for the development of LHCs. The high laser powers (up to 1 kW/cm²) required for single-molecule microscopy limit the range of applications. Thus, new nanoantennas based on the DNA origami technique were developed that lead to an enhanced excitation and emission rate due to the positioning of metallic nanoparticles next to a dye and enable measurements at low laser powers. For further development, which will lead to their use in diagnostic experiments, it is necessary to understand the occurring effects. The main part of this work focuses on the development of a method to correlate the fluorescence properties of dyes with the scattering spectra of adjacent metallic nanoparticles at the single-molecule level and thus to give an insight into the plasmonic effects occurring in these nanoantennas.

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Wünsch, Bettina: Fluoreszenz- und streuungsbasierte Einzelmolekülmikroskopie an DNA-Origami-Nanostrukturen. 2018.

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