Einfluss von Lipidnanopartikeln auf humane Epithelzellen in Mikrosystemen

Pretor, Sascha

Die Interaktion Coumarin 6-beladener SLN (SLN-C) mit Epithel- und Endothelzellen in einem Mikrokanalsystem unter Ruhe- und unter Flussbedingungen war Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Die Toxizität der reproduzierbar mit einer im Rahmen des MikroPART- Projektes entwickelten Mikrokanalanlage hergestellten SLN entsprach in den wesentlichen Punkten den in Vorgängerarbeiten gewonnenen Ergebnissen. Im Rahmen der konfokalmikroskopischen Untersuchung der Coumarin 6 Aufnahme durch Epithel- und Endothelzellen humanen bzw. murinen Ursprungs wurde bereits innerhalb 15-minütiger Inkubation sowohl unter Ruhe- als auch unter Flussbedingungen eine deutliche grüne Coumarin 6 Fluoreszenz beobachtet. Mittels Markierung der SLN mit dem stark lipophilen Fluoreszenzfarbstoff DiI und dem fluoreszenzmarkierten Phospholipid NBD- Dipalmitoyl-sn- glycero-phosphatidylethanolamin (NBD-DHPE) erfolgte die Abgrenzung zwischen Farbstoff- und Partikelaufnahme. Die anschließende Untersuchung mittels Fluoreszenz- und Konfokalmikroskop (CLSM) ergab keinen Hinweis auf eine partikuläre Aufnahme der SLN durch die untersuchten Zelllinien. Eine Modifizierung der Partikeloberfläche mit positiv geladenen Polyelektrolyten, die zu einer Positivierung des Zetapotentials führte, änderte den Befund nicht. Da sich nicht alle fluoreszenzmarkierten Phospholipide für die Homogenisation im Mikrokanal eignen, konnte durch Einarbeitung von DHPE gezeigt werden, dass eine nachträgliche kovalente Bindung des Fluoreszenzfarbstoffes DyLight 488® an die SLN möglich ist. Die schnelle Übertragung des lipophilen Modellarzneistoffes Coumarin 6 auf Humane Cornea Epithelzellen (HCE-T) ermöglichte den Einsatz eines aus Mikrobioreaktoren weiterentwickelten Mikrokanalsystems zur in vitro Darstellung der Applikation eines lipophilen Arzneistoffes am Auge sowie dessen Auswaschen durch Lidschlag und Tränenfluss. Als Träger für Coumarin 6 dienten SLN, Liposomen und der Farbstoff selbst in Form von Mikrokristallen. Unabhängig davon, ob sich das Trägermedium in Ruhe befand oder die Zellen umströmte, erfolgte die Coumarin 6 Übertragung auf HCE-T Zellen in steigendem Ausmaß in der Reihenfolge Mikrokristalle < SLN < Liposomen. Die unter Flussbedingungen periodisch zwischengeschalteten Waschschritte zeigten, dass HCE-T Zellen ein Coumarin 6 Depot ausbilden, welches während des Auswaschens nur langsam an Konzentration verarmte.

In this thesis the interaction of Coumarin 6-loaded solid lipid nanoparticles (SLN-C) with epithelial and endothelial cells of human and murine origin was investigated in a microchannel system under static and under flow conditions. Manufacturing of particles was reproducible by using a micro-manufactured device developed in the context of the MikroPART research project. Particle toxicity was in line with previous publications from our group. Confocal microscopy revealed green fluorescence of Coumarin 6 in epithelial and endothelial cells upon incubation with SLN-C for less than 15 minutes under both static and flow conditions. In order to differentiate between cellular uptake of particles and cellular uptake of the Coumarin 6 molecule itself, particle labeling was done either with DiI as a lipophilic fluorescent dye or with a fluorophore-labeled phospholipid, NBD- dipalmitoyl-sn- glycero-phosphatidylethanolamine (NBD-DHPE). Subsequent investigations via fluorescence and confocal microscopy (CLSM) revealed no cellular uptake of the particles themselves. Modification of the particle’s surface by using positively charged polyelectrolytes leading to a positive zeta potential lead to the same result. Since some fluorophore-labeled phospholipids such as FITC-labeled phospholipids, do not withstand the homogenization procedure during particle manufacturing, subsequent incubation of DHPE-stabilized SLN with a fluorescent dye is also an option as was successfully demonstrated for covalently coupled DyLight 488®. Along with an apparently fast uptake of the model drug Coumarin 6 by Human Corneal Epithelial Cells (HCE-T), a microchannel system further developed from microbioreactors was used for studying the ocular in vitro uptake of Coumarin 6 as a lipophilic model drug with special focus on its clearance due to blinking and tear flow. Coumarin 6 delivery was done by SLN, liposomes and microcrystals of the dye itself for comparison. The amount of Coumarin 6 delivered to HCE-T cells increased in the order microcrystals < SLN < liposomes both under static and under flow conditions. Periodically driven washing steps during flow conditions demonstrated Coumarin 6 incorporation into HCE-T cells. This resulted in an enrichment of Coumarin 6 within the cells which were cleared slowly when being flushed with buffer.

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Pretor, Sascha: Einfluss von Lipidnanopartikeln auf humane Epithelzellen in Mikrosystemen. 2018.

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