The role of ubiquitination during B cell proliferation induced by the Epstein-Barr virus

Großkopf, Henning

Ubiquitin (Ub) is a small protein itself and as a post-translational modification of many proteins implicated in many cellular processes. Ubiquitination is mediated by a three enzyme cascade and counter-regulated by deubiquitinating enzymes (DUBs). The B lymphotropic Epstein-Barr virus (EBV) persistently infects the majority of all adult humans. While the primary infection is largely asymptomatic, latent infection is associated with lymphatic and epithelial neoplastic malignancies. In the process of EBV-associated oncogenesis, latent viral genes interfere with the host cell ubiquitin system. This thesis aimed at the quantitative proteomic description of EBV-specific alterations in the B cell ubiquitin system, entailing the ubiquitination state of cellular proteins and the abundance and activity of ubiquitin-modifying enzymes. Thereby, a particular focus was on the group of deubiquitinating enzymes. Following the systematic analyses, candidate proteins were selected for further characterization of their importance in EBV-transformed B cells. The proteome allowed the quantification of 6161 proteins of which 8% were significantly regulated, including 14 Ub-modifying enzymes. Interestingly, three of these are implicated in monoubiquitination. In total, the ubiquitome study identified 688 novel as well as 218 significantly regulated Ub-sites. Decreased ubiquitination of COTl1 led to the stabilization of the COTL1-ALOX5 complex, which in turn promoted proliferation of transformed cells via stimulation of the leukotriene biosynthesis. This mechanism might be promising to identify a target for the specific treatment of EBV-infected cells. The screening of DUBs with an activity-based probe yielded 30 active DUBs. While Ataxin-3 was downregulated, UCHL1 and USP48 were upregulated by EBV. The expression of USP48 was induced upon B cell activation in general with a synergistic effect of transformation and mitogen stimulation. Furthermore, the nuclear-localized USP48 deubiquitinated the NF-kB subunit RelA in proliferating B cells. Thus, USP48 is regarded as a novel player in B cell activation and as a putative drug target for B cell derived malignancies. In summary, this study provides the first proteomic investigation of EBV-dependent alterations in protein ubiquitination. The data provide novel insight into the mechanisms of B cell transformation and substantially contribute to the determination of involved ubiquitin-mediated cellular processes.

Das Polypeptid Ubiquitin (Ub) ist als posttranslationale Modifikation einer von Proteinen an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt. Ubiquitinierung wird durch drei-stufige Enzymkaskaden vermittelt und von deubiquitinierenden Enzymen (DUBs) gegenreguliert. Das B-lymphotrope Epstein-Barr Virus (EBV) etabliert eine persistierende Infektion in den meisten erwachsenen Menschen. Während die Primärinfektion weitestgehend asymptomatisch verläuft, steht die latente Infektion in Verbindung mit der Entstehung von lymphatischen und epithelialen Neoplasien. Im Zuge der EBV-assoziierten Onkogenese beeinflussen virale Genprodukte das Ub-System der Wirtszellen. In dieser Arbeit wurde die quantitative proteomische Beschreibung der EBV-spezifischen Veränderungen im Ub-System von B-Zellen angestrebt. Die Untersuchung sollte dabei die Analyse des Ubiquitinierungszustandes zellulärer Proteine sowie die Häufigkeit und Aktivität der Ub-modifizierenden Enzyme beinhalten. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Gruppe der DUBs. Anschließend wurden ausgewählte Proteine hinsichtlich ihrer Rolle in der EBV-abhängigen B-Zell-Transformation charakterisiert. Das Proteom umfasste 6161 quantifizierte Proteine von denen 8 % signifikant reguliert waren. Unter diesen waren 14 Ub-modifizierende Proteine, von denen drei an der Monoubiquitinierung von Proteinen beteiligt sind. Die Analyse der Ubiquitinierung ergab 688 bisher nicht beschriebene und 218 regulierte Ub-Stellen. Eine verringerte Ubiquitinierung von COTL1 führte zu einer Stabilisierung des COTL1-ALOX5-Komplexes, der durch eine erhöhte Leukotrien-Biosynthese zur Proliferation von transformierten Zellen beiträgt. Mit Hilfe aktivitätsbasierter Sonden wurden 30 aktive DUBs identifiziert. Dabei war die Menge an USP48 von EBV hochreguliert. EBV abhängige B Zell-Transformation und Mitogen-Stimulation wirkten sich synergistisch auf die USP48-Expression aus. USP48 deubiquitinierte im verwendeten Modellsystem die NF-kB-Untereinheit RelA. Damit ist USP48 ein potentieller neuer Regulator der B-Zell-Aktivierung. Insgesamt stellt diese Arbeit die erste proteombasierte Studie von EBV-spezifischen Veränderungen der Ubiquitinierung in B-Zellen dar. Die Daten erlauben Einblicke in die Mechanismen der EBV-abhängigen B-Zell-Transformation, insbesondere bezüglich Ubiquitin vermittelter zellulärer Prozesse. Eine weitere Charakterisierung der gefundenen Mechanismen könnte zur Entwicklung eines EBV-spezifischen Therapieansatzes beitragen.

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Großkopf, Henning: The role of ubiquitination during B cell proliferation induced by the Epstein-Barr virus. 2018.

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