Protein-Liganden-Modellentwicklung mittels „Higher-Order-Structure“-Methoden und affinitätskapillarelektrophoretischen Bindungsstudien

Nachbar, Markus Alexander

Die zunehmende Automatisierung und die drastisch schneller werdenden Sequenzierungsmethoden für Genome konnte eine Unzahl an Genen entschlüsselt und die codierten Proteine identifiziert werden. Vergleicht man die Anzahl der Einträge in der UniProt-Datenbank für bekannte Proteine (68.493.254 Proteine Stand: 18.10.2016) mit der Anzahl der aufgeklärten Strukturen aus der RCSB Protein Data Bank (120.437 Einträge; Stand: 18.10.2016), so findet man eine große Diskrepanz zwischen diesen beiden Zahlen. Dies ist durch die Notwendigkeit von zeit- und arbeitsintensiven Techniken zur Strukturaufklärung zu erklären. Für Proteinen ohne aufgeklärter Struktur können keine Informationen, wie z. B. Interaktionen, erhalten werden. Zur Erklärung werden 3D-Modelle benötigt. Diese können mit Hilfe der Bioinformatik und Ergebnissen von Techniken zur Bestimmung übergeordneter Strukturen („higher order structures“) sowie Bindungsstudien erstellt werden. Diese Techniken geben nicht nur Aufschluss über die 3D-Strukturelemente eines Proteins, sondern können auch zur Beschreibung von Bindungen verwendet werden. Es geschieht durch Identifikation der notwendigen Aminosäuren und ihrer räumlichen Nähe zu einander. Um den Einfluss von Ionen auf die Proteinstruktur zu untersuchen, eignet sich besonders die Mobility-Shift-Affinitätskapillarelektrophorese (ACE), da hierbei Änderungen der Ladung und der Konformation in Form von Änderungen der Gesamtgröße des Proteins evaluiert werden können. Diese Arbeit verwendet die Informationen aus ACE-Experimenten, um Modelle des Peptids GAPAGPLIVPY für unterschiedliche Bindungsmodi im Vakuum und in wässriger Lösung, und die Bindung von Cu2+ an das Pflanzenprotein AtHIRD11 und seine Domänen D1 und D6 zu erstellen. Diese Ergebnisse wurden mit Modellen für mögliche Zn2+-Bindungen ergänzt. Es wurde auch ein Modell für die Interaktion zwischen Trastuzumab und L-Prolin bzw. L-Histidin erstellt und evaluiert. Die Arbeit zeigt, dass eine Modellentwicklung mit „higher order structure“-Techniken möglich ist und Erkenntnisse durch ACE-Ergebnisse erweitert werden können. Die erhaltenen Modelle eignen sich, um die meisten Eigenschaften zu beschreiben und vorherzusagen. Letztendlich ist eine Strukturaufklärung hierfür notwendig, um die Genauigkeit der „higher order structure“-Techniken und der Molecular Modelling-Ansätzen zu evaluieren. Hierfür empfehlen sich Röntgenstrukturanalyse, Kernspinresonanzspektroskopie und Kleinwinkelröntgenstreuung.

In recent years, the increasing automation and the use of faster genome sequencing techniques led to a myriad of decoded genes. Consequently, many of the encoded proteins were identified. Comparing the number of identified proteins at the UniProt database (68,493,254 proteins; October 18th, 2016) to the entries of determined protein structures at the RCSB Protein Data Bank (120.437 entries; October 18th, 2016), a huge discrepancy is revealed. The main reason for this divergence is the need for time and work intensive techniques to determine protein structures. Therefore, details about protein properties cannot be described precisely without these techniques. It can only be explained properly by their 3D structure. Thus, the development of a model, based on homologies and higher order structures, is required. For this purpose the use of techniques to evaluate these structures and binding studies can be used. These techniques do not only give information about the 3D structure of proteins and as a result their properties. Moreover, they can describe binding sites and therefore the spatial proximity between amino acid residues, which are necessary for binding. To determine the influence of ions on protein structures, mobility shift affinity capillary electrophoresis (ACE) is a suitable technique. Since ions change the overall charge of proteins and consequently their conformations, these alterations can be detected by ACE. This work focuses on the use of ACE to gather information to create models for differences in binding modes in vacuum and aqueous solution for the peptide GAPAGPLIVPY, the binding of Cu2+ towards the plant protein AtHIRD11 and its domains D1 and D6. Furthermore, the results for the domains were completed by models for Zn2+ binding. Additionally, interactions between the monoclonal antibody Trastuzumab and L-proline as well as L-histidine were investigated. This work demonstrates that a model can be established using “higher order structure” techniques and additional information from ACE results. The resulting models are sufficient to represent most protein properties as well as predict protein behavior. Finally, structure determination is required to evaluate the accuracy of the higher order structure investigation outcomes and the molecular modelling approaches. For this purpose, techniques such as X-ray structure determination, NMR spectroscopy and small angle X-ray scattering spectroscopy are recommended.

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Nachbar, Markus: Protein-Liganden-Modellentwicklung mittels „Higher-Order-Structure“-Methoden und affinitätskapillarelektrophoretischen Bindungsstudien. 2017.

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