Characterization of novel halohydrin dehalogenases for application in fine chemical synthesis

Koopmeiners, Julia

Halohydrin dehalogenases (HHDHs) are rare but catalytically remarkable enzymes. They catalyse the cofactor in-dependent reversible dehalogenation of various haloalcohols to the corresponding epoxides and belong to the class of lyases (EC 4.5.1. ). From a practical perspective, HHDHs are especially interesting due to their epoxide ring opening activity in the presence of alternative nucleophiles, such as azide (N3-), cyanide (CN-), nitrite (NO2-), cyanate (OCN-), thiocyanate (SCN-) and formate (HCOO-). This promiscuous epoxide ring opening activity yields the corresponding ß-substituted alcohol product by formation of novel carbon-nitrogen (C–N), carbon-carbon (C–C) or carbon-oxygen (C–O) bonds. Using a sequence motif-based database mining approach, in total 64 putative HHDH sequences were identified from publicly-available sequence databases. This thesis addressed the recombinant production of a selection of these putative HHDH sequences for further characterization studies. Indeed, in initial activity tests activity was validated by dehalogenation of model substrates using cell free extracts of 20 recombinant expressed putative HHDHs. After the identification of optimal expression conditions, 17 HHDHs from all six phylogenetic groups were characterized in depth, including substrate scopes, thermostabilities, enantioselectivity, as well as their application in the industrial important cascade reaction towards ethyl (R)-4-cyano-3-hydroxybutyrate. One novel HHDH, HheG, was shown to convert cyclic epoxides cyclohexene oxide and limonene oxide, which resembles an exception among the other 16 novel as well as the six known HHDHs. To further understand the extraordinary catalytic potential of HheG, structural, kinetic, as well as mutational studies were carried out. Taken together, the findings made in the course of this work contribute to a significant expansion of the structural and functional repertoire for this otherwise rare class of industrially relevant enzymes.

Halohydrin Dehalogenasen (HHDHs) sind seltene, aber katalytisch bemerkenswerte Enzyme. Sie katalysieren die Kofaktor-unabhängige reversible Dehalogenierung verschiedener Haloalkohole zu den entsprechenden Epoxiden und gehören zur Klasse der Lyasen (EC 4.5.1.). Aus praktischer Sicht sind HHDHs aufgrund ihrer Epoxidringöffnungsaktivität in Gegenwart von alternativen Nucleophilen wie Azid (N3-), Cyanid (CN-), Nitrit (NO2-), Cyanat (OCN-), Thiocyanat (SCN-) und Formiat (HCOO-) besonders interessant. Diese promiskuitive Epoxidringöffnungsaktivität ergibt das entsprechende ß-substituierte Alkoholprodukt durch Bildung neuer Kohlenstoff-Stickstoff- (C–N), Kohlenstoff-Kohlenstoff (C–C) oder Kohlenstoff-Sauerstoff (C–O) -Bindungen. Unter Verwendung eines sequenzmotivbasierten database-mining-Ansatzes wurden insgesamt 64 putative HHDH-Sequenzen aus öffentlich verfügbaren Sequenzdatenbanken identifiziert. Diese Arbeit befasste sich mit der rekombinanten Herstellung einer Auswahl dieser mutmaßlichen HHDH - Sequenzen für weitere Charakterisierungsstudien. Tatsächlich wurde in ersten Aktivitätstests die Aktivität durch Dehalogenierung von Modellsubstraten unter Verwendung zellfreier Extrakte von 20 rekombinant exprimierten putativen HHDHs validiert. Nach der Identifizierung der optimalen Expressionsbedingungen wurden 17 HHDHs aus allen sechs phylogenetischen Gruppen charakterisiert, umfassend die Substratspektren, Thermostabilitäten, Enantioselektivität sowie ihre Anwendung in der industriellen wichtigen Kaskadenreaktion zur Herstellung von Ethyl (R) -4-cyano-3 -hydroxybutyrat. Es wurde gezeigt, dass eine neuartige HHDH, HheG, die cyclischen Epoxide Cyclohexenoxid und Limonenoxid umwandelt, was eine Ausnahme unter den übrigen 16 neuen, sowie den sechs bekannten HHDHs entspricht. Um das außerordentliche katalytische Potential von HheG weiter zu verstehen, wurden sowohl strukturelle, kinetische als auch Mutationsstudien durchgeführt. Zusammengenommen tragen die im Zuge dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zu einer signifikanten Ausweitung des strukturellen und funktionellen Repertoires für diese ansonsten seltene Klasse von industriell relevanten Enzymen bei.

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Koopmeiners, Julia: Characterization of novel halohydrin dehalogenases for application in fine chemical synthesis. 2017.

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