Functional analysis of the flagellar type III secretion apparatus in Salmonella enterica serovar Typhimurium

Fabiani, Florian Daniel

The ability of many bacteria to swim trough liquids is not only essential to access more favorable environments but is also crucial for many pathogens to establish a successful infection. Swimming motility is dependent on a macromolecular propeller, the flagellum. Flagellum synthesis requires the translocation of thousands of flagellar subunits across the bacterial cell envelope. This export process depends on a complex nanomachine located at the base of the flagellum, the flagellar Type III secretion system (fT3SS). This apparatus is similar to the virulence associated T3SS (vT3SS) used by Gramm-negative pathogens to inject toxins into the host cell. The fT3SS is composed of six cytoplasmic and seven membrane proteins previously described as essential for export. FliGMN and FliHIJ form the cytoplasmic ring and the flagellar specific ATPase complex, respectively. FlhBA and FliOPQR form the export gate surrounded by the MS-ring made of FliF. Except for FliO, the membrane components are highly conserved among species, and have clear homologs in the vT3SS. Despite intense study on the function and the synthesis of the flagellum, the molecular details of protein export via the fT3SS is poorly understood. It remains unclear which proteins are essential for flagellar substrate export and the function of several of them is unknown. In this thesis, we contributed to untangle the mechanism underlying flagellar Type III secretion. In the first part, we reconstituted a minimal T3SS apparatus, only composed of proteins required and sufficient for export. We uncoupled export of flagellar substrate from synthesis, to measure export in a plasmid- and a chromosomally-encoded minimal T3SS. We determined that FlhBA, FliF and FliPQR are essential and that FliO is only dispensable in presence of excess FliP. In the second part, we investigated the link between FliO and FliP. We demonstrated that FliO prevents Lon-mediated proteolysis of FliP and that FliO facilitates the formations of FliP complexes required for flagellar assembly. We observed that FliO is not part of the completed flagellum. We propose that FliO acts as a specific chaperone for flagellar assembly. In the last part, we examined the role of the cleavable signal peptide of FliP and the effect of its cleavage on motility and flagellar synthesis. We observed that the presence of the signal peptide enhances FliP expression but is not crucial for motility, while cleavage is required for flagellar assembly.

Bakterielle Motilität ist von einem makromolekularen Propeller, dem Flagellum, abhängig. Die Synthese des Flagellums erfordert den Transport von tausenden Untereinheiten durch die bakterielle Zellhülle. Dieser Transport wird von einer komplexen Nanomaschine, dem flagellaren Typ-III-Sekretionssystem (fT3SS), bewerkstelligt. Das fT3SS ähnelt dem Virulenz-assoziierten T3SS (vT3SS), das von Pathogenen verwendet wird, um Toxine in eine eukaryotische Zelle zu injizieren, stark. Das fT3SS setzt sich aus sechs zytoplasmatischen und sieben Membranproteinen zusammen. FliGMN bilden den zytoplasmatischen Ring und FliHIJ die ATPase. Der MS-Ring aus FliF umgibt den aus FlhBA und FliOPQR zusammengesetzten Exportkanal. Außer FliO sind die Membranproteine in verschiedenen Spezies hoch konserviert und haben jeweils ein Homolog im vT3SS. Trotz intensiver Forschung, sind die Details des Proteinexports durch das fT3SS noch nicht gut verstanden. Es ist unklar welche Proteine essentiell für den flagellaren Substratexport sind. Außerdem ist die Funktion einiger Proteine unbekannt. Diese Arbeit soll dazu beitragen den Mechanismus des T3SS aufzuklären. Zunächst wurde versucht ein minimales T3SS zu konstruieren, dass nur aus Proteinen besteht, die notwendig und hinreichend für den flagellaren Export sind. Der Export von flagellarem Substrat wurde von der Synthese entkoppelt, um die Exportrate von Plasmid- und chromosomal codierten minimalen T3SS zu messen. Es wurde ermittelt, dass FlhBA, FliF und FliPQR essentiell sind und FliO nur in Gegenwart eines Überschusses an FliP entbehrlich ist. Anschließend wurde der Zusammenhang von FliO und FliP tiefergehend untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass FliO die Proteolyse von FliP durch die Lon-Protease verhindert. Es wurde bewiesen, dass FliO die Bildung des zur Synthese des Flagellums notwendigen FliP-Komplexes begünstigt. Außerdem wurde beobachtet, dass FliO im fertiggestellten Flagellum nicht vorhanden ist. Es wird postuliert, dass FliO als spezifisches Chaperon die Synthese des Flagellums ermöglicht. Abschließend wurden die Funktion des Signalpeptides von FliP und der Effekt, den dessen Abspaltung auf Flagellensynthese und Motilität hat, erforscht. Es wurde beobachtet, dass das Signalpeptid zwar die Expression von FliP verbessert, seine Abwesenheit die Motilität jedoch nur wenig beeinträchtigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Abspaltung des Signalpetides für die Synthese des Flagellums notwendig ist.

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Fabiani, Florian: Functional analysis of the flagellar type III secretion apparatus in Salmonella enterica serovar Typhimurium. 2017.

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