Analytik von proteinogenen und niedermolekularen Arzneistoffen unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie, Hochauflösender Kontinuumstrahler Atomabsorptionsspektrometrie und weiteren Techniken

Rakow, Tobias Felix

In dieser Arbeit wurden verschiedene Einflussfaktoren auf die Ergebnisse von analytischen Untersuchungen von Arzneistoffen betrachtet. Die Richtigkeit analytischer Verfahren spielt eine zentrale Rolle für die Sicherheit von Arzneimitteln. Die Probenvorbereitung im Rahmen der Analytik wurde für diese Arbeit kritisch betrachtet und hinterfragt. Das Ausmaß der Beeinflussung der Probe hängt von vielerlei Faktoren wie dem pH-Wert der Lösung, der Pufferkonzentration, der Temperatur bzw. Einfriergeschwindigkeit, aber auch von verwendeten (probenberührenden) Materialien, sowie maßgeblich von den Eigenschaften des Analyten selbst ab. Flüssige Proben, die Proteine ohne eine Zellmatrix enthalten, sollten im Gefrierfach bei -8 °C bis -20 °C gelagert werden. Das standardmäßig eingesetzte Sterilfiltrieren von Probenlösungen vor der Messung in der HPLC ist ein sinnvoller Schritt, um Säule und Gerät vor ungelösten Probenbestandteilen und Mikroorganismen bzw. Pilzsporen zu schützen, kann aber auch zu messbaren Adsorptionseffekten führen. Als unkritisch für Proteine erweist sich die Anwendung von Ultraschall. Hierdurch wird das Lösen von Proben beschleunigt und die Lösung wird von gelösten Gasen befreit. Versuche zur Proteinadsorption an verschiedenen Bauteilen und Materialien einer HPLC-Anlage und Größenausschlusssäulen mittels UV-Detektion und hochauflösender Atomspektrometrie zeigten den Einfluss des chromatographischen Vorganges an sich auf proteinhaltige Proben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Untersuchung einer halbfesten Zubereitung durchgeführt, welche die Wirkstoffe Metronidazol und Erythromycin enthielt. Als besonders kritisch ist hier das Kristallwachstum der Wirkstoffe zu sehen. Die flüssigchromatographische Untersuchung nach durchgeführter flüssig-flüssig-Extraktion gab Aufschluss über die hydrolytische Stabilität und den Gesamtgehalt der Wirkstoffe, sowie auftauchender Abbauprodukte. Nach 8 Wochen zeigte sich in allen Zubereitungen mehr als 82% der eingesetzten Ausgangsmenge an Metronidazol, während der Erythromycingehalt in einer der untersuchten Zubereitungen auf 55% absank. Zur Analytik wurde ein Methodentransfer von einer partikulären Trennsäule auf eine monolithische stationäre Phase durchgeführt. Durch die Verwendung eines Monolithen der zweiten Generation (HR-Monolith) konnte in einem nächsten Schritt die ursprüngliche Methode ohne erweiterte Adaption übernommen und dann durch einen Flussratengradienten ohne weitere Anpassungen verkürzt werden.

In this dissertation the factors that have an impact on the result of the analytical investigation itself were examined. The accuracy of analytical methods plays an important role in pharmaceutical drug safety. Pretreatment of samples, indispensable for most analytical methods, has been examined and critically considered. The extent of impact on the sample depends on many factors such as pH value of a solution, concentration of buffer salts, temperature, freezing velocity and not least the surface chemistry of used materials as well as physicochemical properties of the sample. Samples which contain proteins without cell-matrix should be stored at temperatures between -8 °C to -20 °C, if long time storage is needed, because these temperatures turned out to have the least impact on tertiary or quaternary structure. Sterile filtration, which is commonly used in sample preparation for liquid chromatography, turned out as a useful step to protect the HPLC instrument and columns against particles, microorganisms and ubiquitous fungal spores but on the other hand one has to be aware of adsorption effects. Ultrasonication is an almost uncritical way to improve dissolution of a protein and to degas the sample solution. Furthermore, it is a comfortable way to get rid of solved gases in the mobile phase. Protein adsorption on different materials commonly used in a HPLC instrument as well as on size exclusion columns was investigated by using UV-detection and high resolution continuum source atomic adsorption spectrometry. A second part of this dissertation was the investigation of a dermatic creme containing metronidazole and erythromycin. Crystal growth of the two drugs during storage was made out as one of the major critical quality issues. The crystal growth has been investigated. Using liquid-liquid extraction followed by liquid chromatography the content of intact drug molecules as well as of degradation products in the dermatic creme over a period 8 weeks of storage has been determined. After 8 weeks all cremes showed a content of metronidazole above 82 % whilst the content of erythromycin was diminished to 55 % in one of the cremes. To determine the drug content a method transfer from particulate HPLC column to a monolithic stationary phase was performed for the stability study. By using a second generation high resolution monolithic stationary phase (HR-Monolith) this method could be improved by a flow rate program without the need of further adaptation.

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Rakow, Tobias: Analytik von proteinogenen und niedermolekularen Arzneistoffen unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie, Hochauflösender Kontinuumstrahler Atomabsorptionsspektrometrie und weiteren Techniken. 2017.

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