Structure-Polarization Relationship of Fluorescence labelled Samples and Distinction of Subdiffractional Details

Hafi, Nour Murshid Kamel

Fluorescent labelling in optical light microscopy is a very widespread approach to gain detailed insights into the structure of samples under investigation. The orientation of fluorescence markers labelled to various biological structures can be beneficial in obtaining detailed information about their structures. Molecular orientation can be determined using a rotatable half waveplate that rotate the linear polarized light of excitation constantly. The probability of exciting a molecule increases when the angle between the transition dipole moment vector and the oscillation vector of the electric field (light polarization vector) decreases. The excitation of molecules or chromophores occurs when their transition dipole moment is parallel to the polarization of excitation light. Thus, controlling and determining the orientation of the polarization of the excitation light results in determining the orientation of excited molecules. In light microscopy, the challenge is to bypass the diffraction limit in florescence light microscopy. The additional information contained in the orientation of fluorescence markers labelled to various structures was explored. Furthermore, it was examined if it is possible to discern between subdiffractional details of fluorescently labelled samples based on differences in the molecular orientation of their fluorescent dipole moment. A large range of differently labelled samples was investigated: Samples of very low labelling density or of higher label densities. Samples of rather heterogeneous label orientations were compared to samples of rather homogeneous label orientation with close orientation structure relationships. In addition, samples of rather high label mobility were compared to samples with rather fixed labelling. Samples of linear actin filaments that have a well-defined fluorescent markers orientation that persist along the actin fiber were systematically investigated. The investigation demonstrated that subdiffractional details can be observed down to a distance of ~150 nm in actin fibers of various relative polarization angles. Moreover, separations down to ~60 nm are possible when considering specific images at a certain phases (time frames) in the averaged signals of the modulating.

Die Fluoreszenzmarkierung in der optischen Lichtmikroskopie ist ein sehr verbreiteter Ansatz, um detaillierte Einblicke in die Struktur der untersuchten Proben zu erhalten. Eine Orientierung von Fluoreszenzmarkern, welche an verschiedenen biologischen Strukturen gebunden werden können, kann vorteilhaft sein, um detaillierte Informationen über die Strukturen zu erhalten. Die molekulare Orientierung kann unter Verwendung einer drehbaren Halbwellenplatte bestimmt werden, die das linear polarisierte Licht der Anregung konstant dreht. Die Wahrscheinlichkeit der Anregung eines Moleküls wird mit abnehmendem Winkel zwischen dem Übergangsdipolmomentvektor und dem Oszillationsvektor des elektrischen Feldes (Lichtpolarisationsvektor) größer. Die Anregung von Molekülen oder Chromophoren erfolgt, wenn ihr Übergangsdipolmoment parallel zur Polarisation des Anregungslichts ist. Somit führt die Steuerung und Bestimmung der Orientierung der Polarisation des Anregungslichts zur Bestimmung der Orientierung der angeregten Moleküle. Bei der Lichtmikroskopie besteht die Herausforderung darin, die Beugungsgrenze in der Fluoreszenzlichtmikroskopie aufzuheben. Die zusätzlichen Informationen, die in der Orientierung von Fluoreszenzmarkern gebunden an verschiedenen Strukturen enthalten sind, wurden untersucht, Zusätzlich wurde überprüft, ob zwischen Subdiffraktionsdetails von fluoreszenzmarkierten Proben aufgrund der Unterschiede in der molekularen Orientierung ihres fluoreszierenden Dipolmoments unterschieden werden kann. Eine große Auswahl an unterschiedlich markierten Proben wurde untersucht. Zum einen wurden Proben mit sehr geringer bzw. höherer Markierungsdichte getestet, zum anderen, wurden Proben von nahezu heterogener Markierungsorientierung mit Proben von näherungsweise homogener Markierungsorientierung, welche enge Orientierungsstrukturbeziehungen aufweisen, verglichen. Darüber hinaus wurden Proben von ziemlich hoher Markermobilität mit Proben mit ziemlich fester Markierung in Relation gesetzt. Linearen Aktinfilamentproben, die eine gut definierte Fluoreszenzmarkerorientierung entlang der Actinfaser aufweisen, wurden systematisch untersucht. Die Untersuchung zeigt, dass in Aktinfasern subdiffraktionale Details bis zu einer Entfernung von ca. 150 nm mit verschiedenen relativen Polarisationswinkeln beobachtet werden können. Zudem sind Trennungen bis zu ca.60 nm möglich, wenn man bestimmte Bilder bei bestimmten Phasen (Zeitrahmen) in den gemittelten Signalen berücksichtigt.

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Hafi, Nour: Structure-Polarization Relationship of Fluorescence labelled Samples and Distinction of Subdiffractional Details. 2017.

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