Untersuchungen zur funktionellen Charakterisierung von spezifizierenden Proteinen des Glucosinolatstoffwechsels der Brassicaceae

Dörr, Alina Friederike

Pflanzen der Brassicales nutzen das Glucosinolat-Myrosinase-System zur Verteidigung gegen Fraßfeinde und Pathogene. Bei Gewebeverletzung werden Glucosinolate durch Myrosinasen unter Bildung giftiger Isothiocyanate hydrolysiert. In Anwesenheit spezifizierender Proteine entstehen alternative Produkte. Nitril-spezifizierende Proteine (NSPs) führen zur Bildung von Nitrilen. Arabidopsis thaliana besitzt fünf NSP-Gene (AtNSP1-AtNSP5). Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von AtNSP1-AtNSP5 auf die Bildung der Glucosinolat-Abbauprodukte in Homogenaten der Samen und Keimlinge von A. thaliana Col-0 untersucht. Um die Funktion spezifizierender Proteine besser zu verstehen, sollte ihre subzelluläre Lokalisation geklärt werden. Außerdem sollte versucht werden, ihre Interaktion mit der Myrosinase TGG1 in planta nachzuweisen. In Homogenaten der Samen und Keimlinge von A. thaliana Col-0 wurden Glucosinolate vorherrschend zu Nitrilen abgebaut. Die Analyse der T-DNA-Mutanten nsp2-1 und nsp2-2 zeigte, dass AtNSP2 in Samen für die Nitrilbildung verantwortlich ist. Im Homogenat von Keimlingen der nsp1-1-Mutante war die Nitrilbildung gegenüber dem Wildtyp stark reduziert. Daher scheint AtNSP1 in Keimlingen verantwortlich für die Nitrilbildung zu sein. Zudem könnten AtNSP3, AtNSP4 und AtNSP5 zur Nitrilbildung in Keimlingen beitragen. Zur Analyse der subzellulären Lokalisation wurden AtNSP1, AtNSP2, AtNSP4, AtNSP5, At3g07720 und das Thiocyanat-formende Protein aus Thlaspi arvense in Fusion mit dem Fluoreszenzprotein Venus transient in Nicotiana benthamiana exprimiert. Alle untersuchten Proteine waren im Cytosol lokalisiert. Zur Untersuchung der Interaktion zwischen TGG1 und AtNSP3 in planta mittels bimolekularer Fluoreszenz-Komplementation wurden die in verschiedenen Kompartimenten von N. benthamiana-Zellen in Fusion mit Reporter-Fragmenten produzierten Proteine in einem Blattextrakt untersucht. Der Nachweis scheiterte bei Verwendung der Reporter-Fragmente VYNE und SCYCE an einer starken Hintergrundfluoreszenz. Mit mCherry als Reporter war die Hintergrundfluoreszenz geringer, aber kein Fluoreszenzmaximum im Interaktionsansatz nachweisbar. Bei cytosolischer Expression beider Interaktionspartner konnte nur die unglykosylierte Myrosinase (TGG1-oSP) betrachtet werden. Eine Interaktion zwischen TGG1-oSP und AtNSP3 ließ sich dann nachweisen. Entsprechende Untersuchungen mit TGG1-oSP und AtNSP5 bzw. At3g07720 führten nicht zum Nachweis einer Interaktion.

The glucosinolate-myrosinase-system is an important defence mechanism against herbivores and pathogens in members of the Brassicales. If tissue is disrupted, myrosinases hydrolyze glucosinolates and toxic isothiocyanates are formed. In presence of specifier proteins, alternative hydrolysis products are generated. The presence of nitrile-specifier proteins (NSPs) leads to the formation of nitriles. Arabidopsis thaliana possesses five NSP genes (AtNSP1-AtNSP5). The aim of the present work was to analyse the role of AtNSP1-AtNSP5 in nitrile formation in homogenates of seeds and seedlings of A. thaliana Col-0. Furthermore, we wanted to localize specifier proteins within the cell to enable a better understanding of their function. Another aim was to establish the interaction between myrosinase TGG1 and specifier proteins in planta. The main glucosinolate hydrolysis products in homogenates of A. thaliana Col-0 seeds and seedlings were the nitriles. The analysis of the T-DNA-mutants nsp2-1 and nsp2-2 showed that AtNSP2 is responsible for nitrile formation in seeds. In homogenates of seedlings of the nsp1-1 mutant, nitrile formation was reduced relative to the wildtype. This indicates a role of AtNSP1 for nitrile formation in seedlings. In addition, AtNSP3, AtNSP4 and AtNSP5 may contribute. To analyse their subcellular localisation, AtNSP1, AtNSP2, AtNSP4, AtNSP5, At3g07720 and the thiocyanate-forming protein of Thlaspi arvense were transiently expressed in Nicotiana benthamiana in fusion with the fluorescence protein Venus. All analysed proteins were localized in the cytoplasm. To analyse the interaction between TGG1 and AtNSP3 in planta by bimolecular fluorescence complementation, the proteins were produced in separate compartments of N. benthamiana-cells in fusion with the reporter-fragments VYNE and SCYCE and brought together through extraction. This approach failed because of a strong background-fluorescence. With mCherry as reporter, background-fluorescence was reduced, but signal indicating an interaction wasn’t detected. Cytosolic expression of myrosinase without signal peptide (TGG-oSP) allowed the analysis of unglycosylated myosinase. The experiments demonstrated an interaction between TGG1-oSP and AtNSP3. TGG1-oSP was also examined with AtNSP5 or At3g07720, but an interaction could not be demonstrated.

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Dörr, Alina: Untersuchungen zur funktionellen Charakterisierung von spezifizierenden Proteinen des Glucosinolatstoffwechsels der Brassicaceae. 2017.

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