Establishing site-specific recombination mediated cassette exchange in Pichia pastoris and development of an optimized process for the production of mouse Tmprss2

Schinkowski, Christian In-Shu

Structural and biochemical analyses usually require high amounts of highly pure target proteins. Therein, the production of the increasingly demanded complex, difficult to express target proteins often presents a major bottleneck. Hence, the optimization of expression hosts and process strategies is an indispensably important task to pave the way for further studies. The methylotrophic yeast Komagataella phaffii (commonly known as Pichia pastoris) is a widely used expression system for the production of recombinant proteins. It presents an intriguing alternative to the costly mammalian or insect cell culture, as it unites the cost-efficient and simple handling of microorganisms with many of the sophisticated posttranslational processing capabilities of higher eukaryotes. However, the commonly required stable transformation of P. pastoris via homologous recombination results in several drawbacks. These include a limited number of established genomic loci for the integration of genes of interest (GOI). Moreoever, due to the strongly varying expression results of the transformants, extensive expression screens to identify high-producer (“jackpot”) clones are usually required. The first part of this work revolves around the establishment of a recombinase mediated cassette exchange (RMCE) system to optimize the expression system P. pastoris. The specific integration of GOI into a definedly exchangeable genomic cassette of a P. pastoris RMCE master cell line through the enzyme Flp recombinase presents a promising approach to eliminate the expression screening due to comparable productivities of exchanged producer clones. Furthermore, yet uncharacterized genomic loci can be made available for stable protein expression by this system. In this work, the establishment of a P. pastoris RMCE system is shown. The second part of this work deals with the establishment of a method for the secretory production of the ectodomain of the difficult to express transmembrane serine protease mouse Tmprss2 for structural and functional analyses. Tmprss2 plays a key role in influenza A virus infection through proteolytic activation of hemagglutinin H1. The first successful production of both the active form and a mutant form (D343N) of Tmprss2 was achieved in P. pastoris. The expression yields could be significantly improved through several optimizations of the cultivation and purification process.

Die Durchführung strukturbiologischer und biochemischer Analysen erfordert große Mengen an hochreinen Zielproteinen. Dabei steigt die Nachfrage nach komplexen, schwer zu exprimierenden Proteinen stetig, deren Produktion jedoch einen entscheidenden Engpass darstellt. Die Optimierung von Expressionssystemen und Produktionsprozessen ist daher ein wichtiges Unterfangen. Die methylotrophe Hefe Komagataella phaffii (Pichia pastoris) ist ein verbreitetes Expressionssystem zur Herstellung rekombinanter Proteine. Sie vereint die kostengünstige und einfache Handhabung von Mikroorganismen mit der Fähigkeit eine Vielzahl der posttranslationalen Modifikationen höherer Eukaryoten durchzuführen. Dadurch stellt P. pastoris eine interessante Alternative zu kostenintensiven Zellkulturen dar. Jedoch ergeben sich bei der erforderlichen stabilen Transformation von P. pastoris über homologe Rekombination einige entscheidende Nachteile. Diese umfassen eine begrenzte Anzahl etablierter genomischer Loci zur Integration von Zielgenen und eine stark variierende Expressionsleistung transformierter Klone, wodurch in der Regel ein langwieriges Screening nach Hochproduzenten („Jackpot-Klonen“) notwendig ist. Der erste Teil dieser Arbeit behandelt die Etablierung eines Rekombinase vermittelten Kassettenaustauschsystems (recombinase mediated cassette exchange, RMCE) zur Optimierung des Expressionssytems P. pastoris. Die spezifische Integration von Zielgenen in eine definiert austauschbare genomische Kassette einer P. pastoris RMCE Master-Zelllinie durch das Enzym Flp Rekombinase stellt eine vielversprechende Option dar, das Screening nach Jackpot-Klonen durch vorhersagbare Produktionsraten zu verhindern und bisher ungenutzte genomische Loci zur stabilen Proteinexpression zu erschließen. In dieser Arbeit wird die Etablierung eines RMCE Modell-Systems in P. pastoris gezeigt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Methode zur sekretorischen Herstellung der Ektodomäne der schwer zu exprimierenden Maus-Transmembranserinprotease Tmprss2 für strukturelle und funktionelle Analysen beschrieben. Tmprss2 spielt eine Schlüsselrolle in der Influenza A Infektion durch die proteolytische Aktivierung von Hämagglutinin H1. Die erste, erfolgreiche Produktion der aktiven Form von Tmprss2 und einer Mutante (D343N) konnte in P. pastoris erreicht werden. Die Ausbeuten konnten durch Optimierungen der Kultivierung und des Reinigungsprozesses deutlich erhöht werden.

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Schinkowski, Christian: Establishing site-specific recombination mediated cassette exchange in Pichia pastoris and development of an optimized process for the production of mouse Tmprss2. 2017.

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