Role of ATG12-ATG5 conjugate in autophagy regulation

Archna

Autophagy is a catabolic process which contributes to the cellular homeostasis and intracellular pathogen clearance in eukaryotic cells. Since it is a threat for intracellular pathogens, various pathogens have developed strategies to escape from or even exploit autophagy for their survival. In order to understand and be able to interfere with the pathogenic strategies, a detailed insight into the molecular mechanism of autophagy is required. In autophagy mechanism, ATG12-ATG5 conjugate plays central role by interacting with ATG16L1 and TECPR1 protein. Hence, ATG12-ATG5/ATG16L1 and ATG12-ATG5/TECPR1 complex represents a potential target for the specific modulation of individual steps of autophagy. The aim of this project was structural and biochemical characterization of ATG12-ATG5 or ATG5 in complex with ATG16L1 (N-terminal half) and TECPR1_AIR and designing a small molecule inhibitor based on structures of these complexes. In this work, ATG12-ATG5 conjugate and ATG5 were purified in complex with various constructs of ATG16L1 and TECPR1. ATG5/ATG16L1 complex have been successfully crystallized in two different crystal forms. Structures of this complex when solved revealed C-terminal degradation of ATG16L1 during crystallization. Crystallization of ATG5/TECPR1_AIR was challenging and various strategies were employed involving SER mutations, MBP-fusion and the fusion of AIR and ATG5 through a flexible linker. The latter construct was successfully crystallized, but unfortunately the structure of ATG5/TECPR1_AIR was solved by a different group before us; therefore, this part of project was discontinued. To date, modulators of autophagy are rather unspecific as mainly target the upstream regulatory kinases in the autophagy activation process or the acidification of the autolysosome. With the aim of obtaining a highly specific autophagy modulator, a short peptide has been designed based on structures of ATG5/ATG16L1 and ATG5/TECPR1_AIR complexes. In cell culture based assays, quantitative analysis suggested reduction in autophagy particles in presence of the designed inhibitory peptide inside the cells. Using Peptide spot array technique, ten different mutations with improved binding affinity to ATG5 have been identified. Moreover, in order to characterize the central part of ATG16L1, three constructs were designed, expressed, purified and crystallized in order to solve the structure and have detailed insight into the central part of ATG16L1.

Autophagie ist ein katabolischer Prozess eukaryotischer Zellen, welcher zur zellulären Homöostase und Eliminierung von Pathogenen beiträgt. Da Autophagie auch gegen Pathogene gerichtet ist, haben manche Keime Strategien entwickelt, um ihren autophagosomalen Abbau zu inhibieren oder zu umgehen. Um diese Strategien besser zu verstehen und in die Mechanismen der Pathogene einzugreifen, ist ein detaillierter Einblick in die molekularen Prozesse der Autophagie essentiell. Für Autophagie spielt das Proteinkonjugat ATG12-ATG5 eine zentrale Rolle, indem es mit den Proteinen ATG16L1 und TECPR1 interagiert. Damit stellen die Komplexe ATG12-ATG5/ATG16L1 und ATG12-ATG5/TECPR1 potentielle Ziele für gezielte Modulationen einzelner Schritte der Autophagie dar. Ziel dieser Arbeit war die strukturelle und biochemische Charakterisierung von ATG12-ATG5 oder ATG5 im Komplex mit ATG16L1 (N-terminale Hälfte) und TECPR1_AIR, sowie die Entwicklung von auf der Struktur basierender Inhibitormolekülen. In dieser Arbeit wurden ATG12-ATG5 bzw. ATG5 im Komplex mit ATG16L1 und TECPR1 gereinigt. Der ATG5/ATG16L1 Komplex wurde in zwei verschiedenen Kristallformen kristallisiert. Wie die Stukturaufklärung jedoch zeigte, erfolgte während der Kristallisation ein C-terminaler Abbau von ATG16L1. Wegen der anspruchsvollen Kristallisation des ATG5/TECPR1_AIR wurden verschiedene Strategien wie die Reduktion der Oberflächenentropie, Fusion mit dem Maltosebindeprotein, sowie die Fusion von AIR und ATG5 durchgeführt. Letztgenanntes Konstrukt wurde kristallisiert, jedoch erschien in der Zwischenzeit eine Publikation zu dieser Struktur, weswegen Arbeiten an diesem Teil des Projektes eingestellt wurden. Bis heute zielen die meisten Modulatoren der Autophagie auf die regulatorischen Kinasen oder die Ansäuerung des Autolysosoms. Basierend auf den Strukturen von ATG5/ATG16L1 und ATG5/TECPR1_AIR wurde ein Peptid erstellt, welches einen hochspezifischen Modulator der Autophagie darstellen soll. Quantitative Analysen deuten bei Anwesenheit des inhibitorischen Peptids auf eine Reduktion autophagosomaler Partikel in Zellkultur hin. Durch die Verwendung eines Peptid-Spot-Arrays wurden zehn Mutationen auf dem Peptid identifiziert, die verbesserte Bindungseigenschaften zu ATG5 aufweisen. Weiterhin wurden drei Konstrukte des zentralen Teils von ATG16L1 exprimiert, gereinigt und kristallisiert, um die Struktur aufzuklären und damit detaillierte Einblicke in die Funktion dieses Teils von ATG16L1 zu erhalten.

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Archna: Role of ATG12-ATG5 conjugate in autophagy regulation. 2017.

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