Untersuchungen zur XylR-vermittelten Regulation des Xylose-Operons und phänotypischen Heterogenität in Bacillus megaterium

Wienecke, Sarah

Seit vielen Jahren wird Bacillus megaterium für die Produktion von rekombinanten Proteinen als Alternative zum etablierten Escherichia coli genutzt. Dafür wird bislang hauptsächlich das für B. megaterium optimierte Xylose-induzierbare Promotorsystem genutzt. Für die Regulation dieses Systems wird bislang angenommen, dass das Repressorprotein XylR in Abwesenheit von Xylose (reprimierter Zustand) an einen entsprechenden Operator an die DNA bindet und so die Transkription verhindert, während sich XylR bei Anwesenheit von Xylose (exprimierter Zustand) von der DNA löst und die Transkription ermöglicht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Repressor XylRB.meg erfolgreich gereinigt. Damit konnte durch DNA-Bindestudien in An- und Abwesenheit von Xylose erstmals gezeigt werden, dass beide Repressor-Formen (+/- Xylose) an den gleichen Operator binden. Allerdings werden beide Formen unterschiedlich oligomerisiert, sodass die DNA der Promotorregion in Abhängigkeit der gebundenen Repressor-Form unterschiedlich organisiert wird. Mit Hilfe von Footprint-Analysen wurde die Hypothese bestätigt, dass der Xylose-freie Repressor Loop-ähnliche DNA-Strukturen ausbildet, die zur Reprimierung der Transkription führen. Das bestehende Modell der XylR-vermittelten Regulation muss also entsprechend angepasst werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden mögliche Ursachen für die Ausbildung einer phänotypischen Heterogenität während der rekombinanten Proteinproduktion untersucht. Hierfür wurden verschiedene B. megaterium-Mutanten und B. megaterium mit Plasmiden unterschiedlichem Replikationsursprungs getestet. Dabei wurde Gfp als Modellprotein genutzt. Der Einfluss der Expression des Xylose-Transportergens, des Repressor-Induktor Verhältnis bei der Nutzung von Plasmiden hoher Kopienzahlen und die Verteilung von Zellkomponenten während der Zellteilung sollten so bestimmt werden. Durch Fluoreszenz-Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie Gfp-produzierender B. megaterium-Zellen wurde festgestellt, dass die phänotypische Heterogenität während der rekombinanten Gfp-Produktion im Zusammenhang mit einer ungleichen Plasmidverteilung steht. Dabei erhalten die Zellen mit älteren Zellpolen nach jeder Zellteilung mehr Plasmidkopien als die Zellen mit jüngeren Zellpolen, um durch sogenanntes „Bet-hedging“ Vorteile bei sich wechselnden Umweltbedingungen zu haben.

Since many years, Bacillus megaterium is used for the production and secretion of recombinant proteins as an alternative host to the well-characterized Escherichia coli. For this purpose, an optimized xylose-inducible expression system was usually employed. It was postulated that in the absence of xylose the xylose repressor XylR binds to the operator and prevents expression of the following genes. In the presence of xylose XylR binds the sugar, which induces a structural rearrangement responsible for the loss of affinity of XylR for its DNA target and induction of gene expression. So far, no experimental evidence exists for this model, since the DNA-binding behaviour of XylR was not analysed. In the first part of this work the xylose repressor was recombinantly produced and successfully purified. In vitro DNA-binding studies showed that XylR with and also without bound xylose binds to the same operator OxylA. However, both forms of XylR (+/- Xylose) revealed different states of oligomerization, which resulted in a different structural organization of the bound operator DNA. Footprint analyses confirmed the hypothesis, that the xylose-free XylR forms DNA-loop structures causing repression of gene expression. The failure of the DNA bound xylose containing XylR to form these structure allows for gene expression. Based on all results, the postulated model of XylR-DNA binding needs to be adapted. Utilization of the plasmid-based xylose-inducible expression system leads to phenotypic heterogeneity during the recombinant protein production. Hence, in the second part of this work the molecular basis for phenotypic heterogeneity was analysed. For this purpose, B. megaterium mutants were tested with plasmids carrying different origins of replication. Gfp served as model protein. The influence of xylose transporter gene expression, imbalanced repressor-inducer equilibrium due to the utilization of high copy plasmids and unequal distribution of cell components during cell divison were analyzed. Gfp quantification via fluorescence flow cytometry and fluorescence microscopy demonstrated that phenotypic heterogeneity is due to an unequal distribution of plasmids during cell division. The cells harboring an older cell pole receive more plasmid copies after each cell division compared to the cells derived from the younger cell pole. It is assumed that bacteria use this so-called bet-hedging strategy to obtain advantages in a changing environments.

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Wienecke, Sarah: Untersuchungen zur XylR-vermittelten Regulation des Xylose-Operons und phänotypischen Heterogenität in Bacillus megaterium. 2017.

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