Evolutionsgenetik und Phylogeographie von Clostridium difficile Ribotyp 027 in Deutschland

Steglich, Matthias

Das Darmpathogen Clostridium difficile gilt derzeit als der prävalenteste Verursacher Antibiotika-assoziierter, nosokomialer Durchfallerkrankungen in Nordamerika und Europa. Die Bedeutung des Erregers wurde nach Aufsehen erregenden Infektionsausbrüchen in Nordamerika erkannt, die durch den sogenannten Ribotyp 027 verursacht worden waren. Erste flächendeckende Typisierungen deuten auf einen Anstieg der Inzidenz und Verbreitung dieses Ribotyps innerhalb Deutschlands hin. In der vorliegenden Arbeit wurde die Evolution und Ausbreitung von Clostridium difficile Ribotyp 027 mit Hilfe modellgestützter Verfahren anhand von Ganzgenomsequenzen untersucht. Hierfür wurden 57 Isolate schwerer Clostridium-difficile-Infektionen von deutschlandweit hospitalisierten Patienten zunächst mit dem Illumina-Verfahren sequenziert. Zur Referenz-basierten Sequenzrekonstruktion wurde eine vollautomatische Pipeline in Form eines Shell-Skripts (Seqrec-Pipeline) implementiert, sowie Werkzeuge zur Sequenzdatenpräparation. Anhand der Kerngenomsequenzen wurde die Phylogenie der Stammsammlung mittels klassischer Maximum-likelihood-Algorithmen rekonstruiert, wobei durch Einbeziehung von Referenzisolaten einer internationalen Studie gezeigt werden konnte, dass zwei kürzlich beschriebene fluorchinolonresistente Linien (FQR1,FQR2) bereits weitläufig in Deutschland verbreitet sind. Zur Bestimmung von zeitlichen Relationen innerhalb der Phylogenie wurden Bayesianische Verfahren zur Phylogenierekonstruktion, eingesetzt. Womit deutlich gezeigt werden konnte, dass der Import pathogener Erregerstämme des Ribotyps 027 bereits etliche Jahre vor den ersten Berichten über schwerwiegende Ribotyp-027-Infektionen in Deutschland gegen 2007 erfolgt war. Neben der zeitlichen Kalibrierung gestattete die Inkorporierung von Modellen der räumlichen Ausbreitung anstatt bisheriger Momentaufnahmen der Ribotypenverteilung, die Erstellung einer profunden Hypothese zur regionalen Verbreitung innerhalb der Bundesrepublik. Final wurden einige Isolate der Stammsammlung mittels PacBio-Verfahren sequenziert. Durch wesentlich längere Reads gegenüber der Illumina-Technik konnten strukturelle Variationen (Deletionen, Insertionen, Inversionen) innerhalb der Genome analysiert werden. Insgesamt zeigte sich nur eine geringe Zahl an Insertionen und Deletionen bei den Isolaten der Stammsammlung, erheblich weniger als SNPs.

The enteropathogen Clostridium difficile is the most common cause of antibiotic-associated and nosokomial diarrhea in North America and Europe. Its emergence was realized after several outbreaks in North America, associated with ribotype 027. Preliminary typing studies indicated the increase of CDI incidence accompanied by the emergence of Clostridium difficile ribotype 027 in Germany. In this thesis the evolution and spatial spread of Clostridium difficile ribotype 027 was analysed using model based methods incorporating whole-genome sequences. Therefore 57 clinical Clostridium difficile isolates, which had been collected from hospitalized patients throughout Germany were analysed. To reconstruct the sequences from reads an automated pipeline was implemeted (Seqrec-pipeline), as well as several tools for sequence data preparation. Based on core genome data the phylogeny of the strain collection was inferred by applying maximum likelihood algorithms. It has been demonstrated that both, previously described strains of fluoroquinolone-resistant Clostridium difficile strains, FQR1 and FQR2, were present in Germany. Hence several german sub-clusters were identified, discriminated by single nucleotide polymorphism (SNPs). To determine temporal relations of the phylogeny, a Bayesian framework using strict or relaxed molecular clock models for inference of time-measured phylogenies was used. It was demonstrated that long before the first outbreak of C. difficile 027 was noticed in Germany in 2007, newly emerged strains had already been disseminated across hospitals. In addition to time calibrated phylogenies, Bayesian evolutionary analysis allows for incorporation of phylogeographic models. Instead of a snapshot showing the ribotype-dissemination, a profound hypothesis of the pathogen's spread at a regional scale was presented. Finally, several isolates of the strain collection were sequenced by applying the PacBio-technic. As a result significantly longer reads were generated compared to Illumina-sequncing, which enabled authentic reconstruction of structural variations (deletions, insertions, inversions). To verify the results from both technologies, PacBio and Illumina were compared. Altogether not many insertions or deletions could be detected in the sequence alignment from sequences of the strain collection.

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Steglich, Matthias: Evolutionsgenetik und Phylogeographie von Clostridium difficile Ribotyp 027 in Deutschland. 2017.

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