Identification and characterization of interactions between bacterial WxxxE-virulence proteins and host cell proteins

Sokolova, Nadiia Igorivna

Intracellular pathogenic bacteria such as Salmonella or Shigella species manipulate host signaling pathways in order to survive and replicate. They secrete a cocktail of up to 30 virulence factors to the cytoplasm of their eukaryotic host cells using a so-called type III secretion system. Some virulence factors belong to conserved protein families, such as the WxxxE family to which the factors SifA and SifB from Salmonella sp. belong. Most factors of this family embody bacterial GEF-mimics that activate small GTPases of the Rho family in the host. However, no such activity was found for SifA and SifB. The aim of this study was to identify new molecular targets of these WxxxE effector proteins and characterize their interaction with signaling pathways in the host. In this study, I analyzed a number of promising candidates from a previous Y2H screen (Cep70/SifA, DYNLRB1/SifA, CLIP4/SifB) using biochemical and microscopic techniques. The main part of this work focuses on the novel interaction between the Salmonella WxxxE effector protein SifB and the host factor CLIP4, an as yet uncharacterized protein. The interaction surface between the two proteins was mapped to the C-terminal CAP-Gly-domains of CLIP4, which also mediate microtubule binding. SifB interacts specifically with CLIP4, but not with other members of the CAP-Gly-family such as CLIP1, -2 and -3. The data presented here suggest that CLIP4 is a microtubule binding- and bundling protein, which is found on interphase-microtubules of post-mitotic cells in selected tissues. In cultured cells the Salmonella effector protein SifB is distributed diffusely throughout the cytoplasm, but can be recruited to microtubules in the presence of CLIP4. In addition, SifB co-localizes together with CLIP4 at highly dynamic membrane tubules, so called SIFs (Salmonella-induced filaments), which are known to form along microtubules of infected cells. The data obtained here suggest that the host protein CLIP4 interacts with the bacterial virulence factor SifB, which is deposited by Salmonella at the SIF membrane and indirectly recruited to microtubules. This might contribute to anchoring of SIFs to microtubules during late stages of Salmonella infection. This is the first report of a direct interaction between a microtubule-binding host protein and a virulence factor from Salmonella.

Intrazelluläre pathogene Bakterien wie Salmonellen oder Shigellen nutzen und manipulieren die Signalübertragungswege im Wirt, um zu überleben und sich zu replizieren. Dazu sekretieren sie einen Cocktail aus bis zu 30 Virulenzfaktoren über ihr Typ III Sekretionssystem in das Cytoplasma der eukaryotischen Wirtszellen. Manche Virulenzfaktoren gehören konservierten Proteinfamilien an, darunter auch die WxxxE Familie mit dem namensgebenden Motiv, zu der auch die Faktoren SifA und SifB aus Salmonella sp. gehören. Die meisten Faktoren dieser Familie sind bakterielle GEF-Mimetika, die kleine GTPasen der Rho-Familie im Wirt aktivieren. Es wurde jedoch keine solche Aktivität für SifA und SifB gefunden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue molekulare Verbindungen von WxxxE Effektor-Proteinen zu identifizieren und ihre Interaktionen mit den Signalwegen der Wirtszelle zu charakterisieren. In meiner Doktorarbeit habe ich eine Reihe von vielversprechenden Kandidaten aus einem Y2H ‚screen‘ (Cep70/SIFA, DYNLRB1/SIFA, CLIP4/SIFB) mit biochemischen und mikroskopischen Techniken untersucht. Der größte Teil der Arbeit konzentriert sich auf die neue Interaktion zwischen dem WxxxE Effektor-Protein SifB aus Salmonellen und dem Wirtsfaktor CLIP4, einem zuvor nicht charakterisierten Protein. Weiterhin wurde die Bindungsoberfläche zwischen beiden Proteinen kartiert, welche sich in CLIP4 in den C-terminalen CAP-Gly-Domänen befindet, die auch dessen Bindung an Mikrotubuli vermitteln. SifB interagiert spezifisch mit CLIP4 und nicht mit anderen Mitgliedern der CAP-Gly-Familie wie CLIP1, -2 oder -3. Die hier vorgestellten Daten lassen den Schluss zu, dass CLIP4 ein Mikrotubuli-Bindungs- und -Bündelungsprotein ist, welches an Interphasemikrotubuli von postmitotischen Zellen in ausgewählten Geweben lokalisiert. Ich konnte zeigen, dass das Salmonella-Effektor-Protein SifB, welches in kultivierten Zellen diffus über das Zytoplasma verteilt ist, in Gegenwart von CLIP4 an Mikrotubuli rekrutiert werden kann. Darüber hinaus co-lokalisieren die hochdynamischen Membrantubuli (SIFs), die in mit Salmonellen infizierten Zellen gebildet werden mit CLIP4 entlang von Mikrotubuli. Meine Beobachtungen legen nahe, dass das von Salmonellen an die SIF-Membran sezernierte SifB über das Wirtsprotein CLIP4 eine Verbindung zu Mikrotubuli herstellt. Dies könnte möglicherseise zur Verankerung späterer SIFs an Mikrotubuli beitragen. Es handelt sich hier um die erste Beschreibung einer direkten Interaktion zwischen einem Mikrotubuli-assoziierten Wirtsprotein und einem Virulenzfaktor aus Salmonella.

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Sokolova, Nadiia: Identification and characterization of interactions between bacterial WxxxE-virulence proteins and host cell proteins. 2017.

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